609-99-4 / 還原糖和總糖的測(cè)定3,5-二硝基水楊酸比色法

一、目的

掌握還原糖和總糖測(cè)定的基本原理，學(xué)習(xí)比色法測(cè)定還原糖的操作方法和分光光度計(jì)的使用。

二、原理

還原糖的測(cè)定是糖定量測(cè)定的基本方法。還原糖是指含有自由醛基或酮基的糖類，單糖都是還原糖，雙糖和多糖不一定是還原糖，其中乳糖和麥芽糖是還原糖，蔗糖和淀粉是非還原糖。利用糖的溶解度不同，可將植物樣品中的單糖、雙糖和多糖分別提取出來(lái)，對(duì)沒(méi)有還原性的雙糖和多糖，可用酸水解法使其降解成有還原性的單糖進(jìn)行測(cè)定，再分別求出樣品中還原糖和總糖的含量（還原糖以葡萄糖含量計(jì)）。

還原糖在堿性條件下加熱被氧化成糖酸及其它產(chǎn)物，3,5-二硝基水楊酸則被還原為棕紅色的3-氨基-5-硝基水楊酸。在一定范圍內(nèi)，還原糖的量與棕紅色物質(zhì)顏色的深淺成正比關(guān)系，利用分光光度計(jì)，在540nm波長(zhǎng)下測(cè)定光密度值，查對(duì)標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算，便可求出樣品中還原糖和總糖的含量。由于多糖水解為單糖時(shí)，每斷裂一個(gè)糖苷鍵需加入一分子水，所以在計(jì)算多糖含量時(shí)應(yīng)乘以0.9。

三、操作步驟

1. 制作葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

取7支20mL 具塞刻度試管編號(hào)，按表1分別加入濃度為1mg/mL 的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液、蒸餾水和3,5-二硝基水楊酸（DNS）試劑，配成不同葡萄糖含量的反應(yīng)液。

2. 樣品中還原糖和總糖的測(cè)定

（1）還原糖的提取

準(zhǔn)確稱取3.00g 食用面粉，放入100mL 燒杯中，先用少量蒸餾水調(diào)成糊狀，然后加入50mL 蒸餾水，攪勻，置于50℃恒溫水浴中保溫20min，使還原糖浸出。將浸出液（含沉淀）轉(zhuǎn)移到50mL 離心管中，于4000r/min下離心5min,沉淀可用20mL 蒸餾水洗一次，再離心，將二次離心的上清液收集在100mL容量瓶中，用蒸餾水定容至刻度，混勻，作為還原糖待測(cè)液。

（2）總糖的水解和提取

準(zhǔn)確稱取1.00g食用面粉，放入100mL三角瓶中，加15mL蒸餾水及10mL 6M HCl，置沸水浴中加熱水解30min（水解是否完全可用碘-碘化鉀溶液檢查）。待三角瓶中的水解液冷卻后，加入1 滴酚酞指示劑，用6mol/LNaOH 中和至微紅色，用蒸餾水定容在100mL容量瓶中，混勻。將定容后的水解液過(guò)濾，取濾液10mL，移入另一100mL容量瓶中定容，混勻，作為總糖待測(cè)液。

（3）顯色和比色

取4支20mL 具塞刻度試管，編號(hào)，按表2 所示分別加入待測(cè)液和顯色劑，空白調(diào)零可使用制作標(biāo)準(zhǔn)曲線的0號(hào)管。加熱、定容和比色等其余操作與制作標(biāo)準(zhǔn)曲線相同。