65-46-3 / 胞苷的應(yīng)用和制備

背景及概述^[1]

胞苷即胞嘧啶核苷，是組成核酸的一種核糖核苷(含有嘧啶堿基胞嘧啶)，并構(gòu)成遺傳密碼的一個單位。胞苷在脫氧核糖核酸和胞核糖核酸中與相應(yīng)的鳥(便嘌呤)苷以非共價形式配對。前已有多種合成胞嘧啶核苷（胞苷）的方法，具體如下：1）Nishimara等人在1964年提出的方法，利用硅醚化保護(hù)的N4-乙酰基胞嘧啶與1-氯代三苯基甲?；颂窃诩訜峄亓鳁l件下反應(yīng)生成混合構(gòu)型胞苷，然后利用重結(jié)晶和柱層析將二種異構(gòu)體分離。該方法的缺點(diǎn)是流程復(fù)雜、收率低，其原料1-氯代三苯基甲酰基核糖不易得到，且是α，β兩種構(gòu)型混合體，其參與反應(yīng)后生成物也是兩種異構(gòu)體，后處理困難。該方法無法實(shí)現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)。2）利用尿苷為原料，經(jīng)六甲基二硅胺烷（HMDS）硅醚化得到4，2′，3′，5′-四硅醚化尿苷，然后在干燥的容器中一步高壓氨解得到胞苷。該方法中尿苷原料昂貴，且脫保護(hù)反應(yīng)條件苛刻，收率低難以工業(yè)化生產(chǎn)。

應(yīng)用^[2]

胞苷作為嘧啶核苷，主要用于生產(chǎn)抗腫瘤、抗病毒藥物的中間體，是制造阿糖胞苷(Ara-CR)、環(huán)胞苷(CycloC)、三磷酸胞苷(CTP)、胞二磷膽堿(CDP-Choline)等藥物的主要原料[2]。其應(yīng)用舉例如下：制備5′-胞苷酸，包括以下步驟：胞苷的合成：胞嘧啶與D-核糖在合成酶Ⅰ的催化作用下合成胞苷，將反應(yīng)所得溶液進(jìn)行過濾得到胞苷過濾液；5′-胞苷酸母液的制備：胞苷過濾液中和磷酸二氫鈉在合成酶Ⅱ的催化作用下合成5′-胞苷酸，所得反應(yīng)液保溫?cái)嚢枰欢螘r間后過濾得到5′-胞苷酸母液；5′-胞苷酸的精提：調(diào)節(jié)5′-胞苷酸母液的pH，而后過濾得到5′-胞苷酸粗品，將5′-胞苷酸粗品精制得到產(chǎn)品5′-胞苷酸。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是：可降低5′-胞苷酸的生產(chǎn)成本；工藝周期較短，可提高5′-胞苷酸的制備效率；產(chǎn)品5′-胞苷酸的總收率達(dá)到90%以上，含量大于99%；對環(huán)境、設(shè)備及操作人員均無害。

制備^[3-4]

方法1：化學(xué)合成法。一種胞嘧啶核苷的制備方法，包括以下步驟：

①硅烷化：將胞嘧啶和叔丁基二甲基氯硅烷經(jīng)硅烷化反應(yīng)得N-(叔丁基二甲基硅基)-2-(叔丁基二甲基硅氧基)-4-嘧啶胺，將N-(叔丁基二甲基硅基)-2-(叔丁基二甲基硅氧基)-4-嘧啶胺在三氯甲烷中溶解得到N-(叔丁基二甲基硅基)-2-(叔丁基二甲基硅氧基)-4-嘧啶胺的三氯甲烷溶液；

②糖苷合成：將四乙酰核糖在三氯甲烷中溶解后加入四氯化鈦溶液，在18℃～30℃的環(huán)境溫度下滴加N-(叔丁基二甲基硅基)-2-(叔丁基二甲基硅氧基)-4-嘧啶胺的三氯甲烷溶液，經(jīng)糖苷反應(yīng)得胞嘧啶乙酰核糖；

③氨解：在18℃～30℃的環(huán)境溫度下向胞嘧啶乙酰核糖中加入氨的質(zhì)量百分濃度為10%的氨的甲醇溶液（即甲醇氨溶液），經(jīng)氨解反應(yīng)得胞嘧啶核苷粗品；

④精制：將胞嘧啶核苷粗品加入乙醇中，在攪拌下加熱回流溶解后加水，冷卻至0℃±2℃析晶至少5h后分離出固體，干燥，得到胞嘧啶核苷。

具體合成路線如下：

方法2：微生物法。由大腸桿菌變異株產(chǎn)生嘧啶核苷。

1）大腸桿菌中嘧啶核苷酸的生物合成途徑

大腸桿菌的嘧啶核苷酸合成途徑與枯草芽孢桿菌類似。在大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)，也主要存在兩種途徑合成核苷酸，一條是利用葡萄糖等碳源和氮源，以5′-磷酸核糖為出發(fā)物質(zhì)的全合成途徑（denovopathway），一條是由嘧啶堿基通過核糖基化及磷酸化而合成的補(bǔ)救途徑。

2）胞苷合成的代謝調(diào)節(jié)機(jī)制

大腸桿菌嘧啶核苷酸生物合成及代謝控制過程如圖所示。

研究表明，與枯草芽孢桿菌不同，大腸桿菌中嘧啶核苷酸的生物合成只在三個控制點(diǎn)上受到終產(chǎn)物的反饋控制，催化這三步反應(yīng)的酶都是變構(gòu)酶。將天冬氨酸與氨甲酰磷酸轉(zhuǎn)變?yōu)榘奔柞Ｌ於彼岬姆磻?yīng)是此途徑的關(guān)鍵步驟，催化此反應(yīng)的天冬氨酸-轉(zhuǎn)氨甲酰酶接受終產(chǎn)物CTP的反饋抑制，它被抑制將影響尿苷酸和胞苷酸的合成。另兩個調(diào)節(jié)位點(diǎn)分別是由氨甲酰磷酸合成酶催化的反應(yīng)，它受UMP的反饋抑制；CTP合成酶催化的反應(yīng)，接受CTP的反饋抑制，它只影響胞苷酸的合成。在大腸桿菌胞苷從頭合成途徑中，UMP合成酶系和CTP合成酶系受到尿嘧啶核苷酸和胞嘧啶核苷酸的反饋抑制，而胞苷脫氨酶使胞苷進(jìn)一步反應(yīng)生成尿苷。首先利用Red重組系統(tǒng)敲除胞苷脫氨酶基因cdd，切斷胞苷進(jìn)一步代謝為尿苷的分解途徑，得到胞苷脫氨酶缺失菌株。然后在此基礎(chǔ)上，再轉(zhuǎn)入一個構(gòu)建好的重組質(zhì)粒，該質(zhì)粒過表達(dá)胞苷生產(chǎn)菌上嘧啶操縱子的結(jié)構(gòu)基因pyr，此基因編碼UMP從頭合成途徑中的6個關(guān)鍵酶，經(jīng)過這些改造后，得到一株基因工程菌，胞苷產(chǎn)量有不同程度地提高。

主要參考資料

[1] 現(xiàn)代藥學(xué)名詞手冊

[2] CN201710615002.5一種5′?胞苷酸的酶催化合成工藝

[3] CN201210168051.6一種胞嘧啶核苷的制備方法

[4] 微生物發(fā)酵法生產(chǎn)胞嘧啶核苷的研究進(jìn)展