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β-半乳糖苷酶（英語：β-galactosidase）是一種水解酶，催化β-半乳糖苷水解成單糖。使β-半乳糖苷酶作用的底物包括神經(jīng)節(jié)苷脂GM1、乳糖苷、乳糖、各種糖蛋白。
β-半乳糖苷酶是一種糖苷外切酶，專門水解在半乳糖和其有機(jī)部分之間的β- 糖苷鍵。它也可能裂解巖藻糖和阿拉伯糖所形成的糖苷，但是效率比較低。 它是人體中所必需的酶。 在此蛋白質(zhì)不足的情況下可能導(dǎo)致Galactosialidosis(為一種溶酶體儲積病)或莫爾基奧乙綜合征。在大腸桿菌中的β-半乳糖苷酶的基因--lacZ的基因?yàn)檎T導(dǎo)型系統(tǒng)的一部分，乳糖操縱子是于低血糖時(shí)在乳糖的存在下被激活。
分子生物學(xué)中經(jīng)常使用β-半乳糖苷酶作為監(jiān)測基因表達(dá)的指標(biāo)印記。β-半乳糖苷酶也表現(xiàn)出藍(lán)/白篩選重組復(fù)制中稱之為α-互補(bǔ)形成的現(xiàn)象。這種酶可以分開為二種勝肽，分別為LacZ基因α和LacZΩ，這兩者自身份別都不是反應(yīng)端，但是當(dāng)兩者同時(shí)存在時(shí)，會自發(fā)地重新組合成一個有功能的酶。 這個特性被利用在許多復(fù)制載體(克隆)，其中在有l(wèi)acZα基因的質(zhì)體表現(xiàn)可以將實(shí)驗(yàn)室的大腸桿菌病株中的LacZΩ基因轉(zhuǎn)換為另一個突變基因。然而，當(dāng)DNA片段插入到載體中，制作LacZα的被打亂，因此細(xì)胞沒有表現(xiàn)β-半乳糖苷酶的活性。β-半乳糖苷酶活性表現(xiàn)的存在與否可透過X-gal的檢測來判斷，如果質(zhì)體沒有插入此外來基因，就能成功表現(xiàn)出β-半乳糖苷酶的活性，就能成功分解X-gal，使菌落成為藍(lán)色。反之，插入外來基因的質(zhì)體無法分解X-gal(因?yàn)棣?半乳糖苷酶無法表現(xiàn))，而成為白色的菌落。
1995年，由Dimri等人。提出了β-半乳糖苷酶具有在PH 6.0 的新亞型（衰退與β-半乳糖苷酶和SA-β-半乳糖苷酶(衰老)有關(guān)）這被拿來特別表達(dá)老化（細(xì)胞的不可逆的生長停滯）。具體的定量測定法甚至開發(fā)了他的感應(yīng)檢測。然而現(xiàn)在已經(jīng)知道，這是溶酶體內(nèi)源β-半乳糖苷酶的積累，而使其過度表現(xiàn)不需要的衰老。盡管如此，它仍然是最廣泛使用在衰老以及衰好細(xì)胞的生物標(biāo)記物，因?yàn)樗哂邢喈?dāng)可靠的和容易檢測之特性。
24個氨基酸中的β-半乳糖苷酶最初是在1970定序出來，而其結(jié)構(gòu)是在24年后，也就是1994年確定該蛋白是一個464 - kDa的 同源四聚體與2,2,2點(diǎn)對稱性且每個單元的β-半乳糖苷酶包括了五個領(lǐng)域; 第一區(qū)域是膠卷型桶，第二區(qū)域和第四區(qū)域?yàn)槔w連蛋白III型狀的桶，第五區(qū)域是β-三明治型，而中央的第三區(qū)域是TIM型桶。
活性端位于第三個結(jié)構(gòu)域?；钚远耸怯伤木垠w兩個亞基的元素所組成的，并且在四聚成二聚體活性端的解離除去中的扮演關(guān)鍵要素。β-半乳糖苷酶的末端序列中，α-肽參與了于亞基界面中的的α-互補(bǔ)。其殘基22-31幫助以穩(wěn)定的四螺旋束形成該界面的主要結(jié)構(gòu)，殘基13和15則有助于激活接口。這些結(jié)構(gòu)上的特征為為α-互補(bǔ)的現(xiàn)象，為缺失的氨基末端片段的結(jié)果在非活性二聚體的形成提供一個合理的解釋。
β-半乳糖苷酶的活性端通過“淺層”與“深層”結(jié)合基質(zhì)來催化水解雙糖。一價(jià)的鉀離子（K +），以及二價(jià)的鎂離子（鎂2 +）需要酶的最佳活性。以β-核苷間鍵為基質(zhì)經(jīng)由谷氨酸側(cè)鏈上的羧基終端裂解而成。 在大腸桿菌中，谷氨酸-461被認(rèn)為是取代反應(yīng)的親核試劑。然而，現(xiàn)在已經(jīng)知道谷氨酸-461是一種酸[催化劑]。相反的，谷氨酸-537為實(shí)際的親核試劑，他是結(jié)合到半乳糖的中間體。
在人類中，是由Glu-268扮演水解反應(yīng)的親合試劑。
β-半乳糖苷酶所催化的反應(yīng)