9032-75-1 / 果膠酶分離純化的方法有哪些？

【背景及概述】^[1][2][3]

隨著分析手段的不斷提高，人們進(jìn)一步了解到果膠的分子結(jié)構(gòu)并開(kāi)發(fā)出相應(yīng)酶類(lèi)，從而使果膠酶的應(yīng)用進(jìn)入一個(gè)新的蓬勃發(fā)展時(shí)期，其應(yīng)用已不再停留在最初的飲料加工上，而是在糧油加工、紡織、造紙、化妝品等行業(yè)都有所發(fā)展，在與天然產(chǎn)物提取相關(guān)的精細(xì)化工、醫(yī)藥等領(lǐng)域也有了階段性的進(jìn)展，果膠酶的固定化研究也正在逐步深入。能分解果膠質(zhì)的酶被稱為果膠酶。目前，國(guó)內(nèi)外在果膠酶方面的研究正在廣泛深入地進(jìn)行。果膠酶工業(yè)應(yīng)用的商業(yè)利潤(rùn)促進(jìn)了對(duì)其研究及開(kāi)發(fā)，全界有很多廠商生產(chǎn)果膠酶制劑，并且隨著技術(shù)的進(jìn)步，令生產(chǎn)成本下降，應(yīng)用的范圍也越來(lái)越廣。果膠酶廣泛分布于高等植物和微生物中，在某些原生動(dòng)物和昆蟲(chóng)中也有發(fā)現(xiàn)。在微生物中，細(xì)菌、放線菌、酵母和霉菌都能代謝合成果膠酶。果膠酶一般分為原果膠酶、果膠水解酶、果膠裂解酶和果膠酷酶等。目前果膠酶在食品、紡織、醫(yī)藥、造紙、環(huán)境、生物技術(shù)、飼料等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。

【分布】^[1]

果膠酶是指能夠分解果膠物質(zhì)的多種酶的總稱，果膠分子是由不同酯化度的半乳糖醛酸以糖苷鍵聚合而成的多糖鏈!常帶有鼠李糖、阿拉伯糖、半乳糖、木糖、海藻糖、芹菜糖等組成的側(cè)鏈，游離的羧基部分或全部與鈣、鉀、鈉離子、特別是與硼化合物結(jié)合在一起。果膠結(jié)簡(jiǎn)圖如下：

許多霉菌及少量的細(xì)菌和酵母菌都可產(chǎn)生果膠酶，主要以曲霉和桿菌為主。 新近報(bào)道的其它菌有青霉如意大利青霉、擴(kuò)展青霉以及Penicilliumgriseoroseum等，白絹菌、立枯絲核菌、微小毛霉、高大毛霉、熱解糖梭菌、匐枝根霉、出芽短梗霉、粗糙鏈孢霉嗜熱側(cè)孢霉等。由于真菌中的黑曲霉屬于公認(rèn)安全級(jí)，其代謝產(chǎn)物是安全的，因此目前市售的食品級(jí)果膠酶主要來(lái)源于黑曲霉，最適pH 值一般在酸性范圍。近年來(lái)，一些來(lái)源于細(xì)菌桿菌屬的堿性果膠酶日益受到重。隨著分子生物學(xué)技術(shù)的不斷提高，也可利用基因克隆技術(shù)實(shí)現(xiàn)膠酶在其它微生物宿主的表達(dá)。

【分類(lèi)】^[1]

果膠酶大致分為果膠水解酶、果膠裂解酶、果膠酯酶和原果膠酶等，其中果膠水解酶又可分為聚半乳糖醛酸酶、聚半乳糖醛酸甲酯水解酶、聚鼠李半乳糖醛酸酶、阿拉伯聚糖酶、半乳聚糖酶、木糖基半乳糖醛酸酶等，由于人們對(duì)PG 的認(rèn)識(shí)最早、應(yīng)用最廣泛，因此早先常被稱為果膠酶。為避免發(fā)生概念混淆，國(guó)際上常用Pecto lytic Enzyme 來(lái)代替Pectinase。

【分離純化】^[2]

果膠酶分離純化的方法有很多種，可根據(jù)具體情況選擇應(yīng)用。

1.粗酶液的制備

粗酶液的制備通常來(lái)自：1）無(wú)細(xì)胞的微生物培養(yǎng)基上清液；2）含有果膠酶的植物組織浸出物；3）微生物感染植物后該植物組織浸出物。第一種方法來(lái)源于微生物的酶，如果是細(xì)胞外酶，粗酶液制備比較簡(jiǎn)單，即通過(guò)過(guò)濾或離心去除菌體即可。如果是細(xì)胞內(nèi)酶，則需要利用超聲波法、酶解法、堿、去垢劑法以及研磨法等破碎細(xì)胞，使酶釋放出來(lái)。對(duì)于第二、第三種方法從植物組織提取酶，需要對(duì)植物組織進(jìn)行勻漿。提取過(guò)程保持低溫對(duì)酶的穩(wěn)定有益處。此外鹽濃度、緩沖液成分以及pH都對(duì)提取的收率有影響。用磷酸鈉溶液成功提取了來(lái)自西紅柿的內(nèi)切果膠酸鹽裂解酶，并用含氯化鈉的乙酸緩沖液提取了地錢(qián)植物組織中外切聚半乳糖醛酸酶。

2.硫酸銨鹽析

制得的粗酶液，通常需要進(jìn)行硫酸銨鹽析沉淀。一般采用60 %～ 90 %飽和度的硫酸銨分離來(lái)自B。Subti lis的果膠裂解酶在F.pectinororum 果膠裂解酶粗酶液加55 %～85 %硫酸銨飽和度可以使99 %的裂解酶分離出來(lái)而比活性大大提高。從馬鈴薯病原體Fusarium roseum 中60 %～80 %硫酸銨沉淀組分經(jīng)透析得到大部分裂解酶，進(jìn)一步提純可使比活性提高117 倍。用硫酸銨將來(lái)自Phomamedicaginisvar pinodella 的果膠裂解酶純化了6倍。采用85 %飽和度的硫酸銨鹽析法將來(lái)自Cort icium rol f si i 的聚半乳糖醛酸酶純化了8 倍，酶收率52 %。用硫酸銨鹽析法從Aspergi llus japonicus 中提取了果膠裂解酶，酶收率達(dá)87 %。

3.有機(jī)溶劑沉淀

另一種用于初步提純、濃縮果膠酶的方法是有機(jī)溶劑沉淀法，通常使用的有機(jī)溶劑有甲醇、乙醇、丙醇和丙酮。同硫酸銨鹽析比較，使用有機(jī)溶劑沉淀酶的最大缺點(diǎn)是造成酶部分失活。將來(lái)自Botry tis cinerea Pers 的果膠酯酶與聚半乳糖醛酸酶分別用20 %和66 %的丙酮沉淀，將這兩種酶分別純化了5 倍和6 倍。

4.層析

果膠酶經(jīng)過(guò)硫酸銨鹽析和有機(jī)溶劑沉淀后，可采用離子交換層析法進(jìn)一步提純。分離來(lái)自Phy tophthora infestans 的果膠酯酶采用了CM-纖維素柱層析法，在pH6.5 條件下以10mmol/ L 磷酸鈉溶液平衡，再用線性梯度的氯化鈉溶液平衡，得到兩個(gè)果膠酯酶的峰，分離效果較好。DEAE-纖維素也是分離酶的良好載體，同樣也已被成功地用在分離果膠酶研究上。另外，親和層析在酶的分離中也有一定應(yīng)用。

5.其他方法

聚丙烯酰胺凝膠電泳作為一種分析手段已被用于檢測(cè)制備果膠酶的均一性。分離來(lái)自Cytophagejohnsoni i 的果膠裂解酶在pH 8.6 和pH 4.3 都顯示了單一帶，說(shuō)明已獲得了均一的蛋白。通過(guò)圓盤(pán)電泳在pH 8.9 對(duì)胡蘿卜果膠酶分析走出一條帶說(shuō)明純化是成功的。等電聚焦法也被應(yīng)用到純化果膠裂解酶。用等電聚焦法分析來(lái)自phoma medicaginisvar pinodella 的果膠裂解酶，得到一條帶，與傳統(tǒng)的圓盤(pán)電泳結(jié)果一致。Sephadex 凝膠過(guò)濾法也是果膠酶純化過(guò)程常用的手段之一。選擇不同Sephadex 可以達(dá)到分離果膠酶的目的。超離心技術(shù)也已被廣泛應(yīng)用到檢測(cè)純化的果膠酶均一性和測(cè)定該成分的沉降系數(shù)。來(lái)自酵母的聚半乳糖醛酸酶經(jīng)純化后用超離心方法確證其單一的活性成分。由于不同來(lái)源的果膠酶成分復(fù)雜，給分離帶來(lái)一定困難，因此高效液相色譜作為一種快速有效的分析分離方法在酶分離純化上也得到一定的重視與研究.

【應(yīng)用】^[1][3]

1. 利用果膠酶瓦解植物細(xì)胞的細(xì)胞壁

1）果蔬汁的生產(chǎn)，果酒的澄清：目前，在大部分的原果汁、濃縮果汁的生產(chǎn)過(guò)程中，都在使用果膠酶。 由于各種水果中果膠的含量差別較大，而且果膠質(zhì)的成分也略有差異，因此，要根據(jù)不同品種、不同加工目的來(lái)確定果膠酶的酶組成。 由于PG 的專一性對(duì)果膠的酯化度要求不如PL 高，在澄清果汁方面往往注重以PG 為主的酶組成，而在提高浸出汁，特別是自流汁方面往往注重使用以PL 為主的酶制劑。

2）天然產(chǎn)物的提?。禾烊簧厝缙咸炎?、番茄紅、紫蘇紫、蘿卜紅等均可使用酶法提取，但所用果膠酶不得含有花青素酶等雜酶以免影響某些產(chǎn)品色澤。其次，天然生物活性物質(zhì)提取物是目前中藥進(jìn)入國(guó)際市場(chǎng)的一種理想方式，出口比例已超過(guò)中藥，并呈上升趨勢(shì)?？衫霉z酶生產(chǎn)的提取物有：銀杏葉提取物、大蒜油濃縮液、蘑菇濃縮液、人參漿、當(dāng)歸浸膏、甘草液等。另外，在金耳多糖、香菇多糖、金針菇多糖、山楂葉總黃酮等的提取中也使用了果膠酶。利用酶類(lèi)提取，不僅可提高萃取率，還可提高純度。另外，在油料萃取方面，按照傳統(tǒng)的生產(chǎn)工藝，菜籽油、棕櫚油、葵花籽油、橄欖油等一般是由正己烷等脂溶性溶劑萃取制得，而正己烷是一種致癌物質(zhì)。將果膠酶和纖維素酶、半纖維素酶結(jié)合使用，可破壞油料作物的細(xì)胞壁，便于油料的釋放，從而提高萃取率。由于酶法提取條件溫和，油料中多酚物質(zhì)和VE 都有所增加，從而提高油料的穩(wěn)定性。

3）紡織品的生物脫膠：用堿性果膠酶處理，代替堿對(duì)棉、麻等織物進(jìn)行煮練加工和整理工藝，以去除初生胞壁中的果膠物質(zhì)，在比較緩和的pH值和溫度條件下使處理后的織物手感柔軟，強(qiáng)度高，取代了耗能大、污染嚴(yán)重的傳統(tǒng)熱堿脫膠工藝。另外，可避免因微生物處理造成的纖維素的降解。

4）造紙業(yè)的生物制漿：造紙工業(yè)中的生物制漿與紡織品的生物脫膠類(lèi)似，都是通過(guò)果膠酶等酶處理降解植物纖維原料中的果膠、半纖維素及木質(zhì)素，使其分散成滿足造紙工業(yè)不同要求的束纖維或單纖維，以生產(chǎn)柔軟、均一、有彈性的高品質(zhì)材料。由于紙漿中高分子果膠帶負(fù)電荷，經(jīng)酶降解至六糖以下即可將其除去，避免了成品紙的靜電現(xiàn)象。

2. 部分分解細(xì)胞間質(zhì)中的果膠物質(zhì)

1）帶果肉食品的生產(chǎn)：一般常規(guī)加工所得到的果肉在必要的高溫處理或機(jī)械泵出后，成型顆粒量明顯減少，硬度降低，直接影響了產(chǎn)品品質(zhì)。果膠質(zhì)在PE 作用下脫去甲氧基，在鈣離子存在下形成凝膠，從而保持了果肉原有的形狀和硬度。以此為基料的產(chǎn)品有果汁、果凍、果肉酸奶、果肉冰淇淋等。

2）單細(xì)胞產(chǎn)品的生產(chǎn)：所謂單細(xì)胞產(chǎn)品是指將生物組織進(jìn)行轉(zhuǎn)化而形成的完整的單細(xì)胞懸液。酶法降解植物細(xì)胞間質(zhì)中的果膠物質(zhì)產(chǎn)生完整的單細(xì)胞懸液的過(guò)程稱為浸解作用。在浸解過(guò)程中，一方面設(shè)法使內(nèi)源性果膠酯酶滅活，避免細(xì)胞軟化；另一方面，用外源果膠酶適度降解胞外果膠及其它成分，避免胞內(nèi)物質(zhì)泄漏，降低品質(zhì)。工藝常用于生產(chǎn)帶肉果蔬汁飲料、乳制品的配料、即食的干燥土豆泥、胡蘿卜泥等食品，以及蘆薈、人參、越橘葉、紅花等美容保健品的配料。

3. 利用果膠酶生產(chǎn)果膠低聚糖

1）以果膠為底物生產(chǎn)低聚果膠：PG 可水解細(xì)胞壁中的果膠成分產(chǎn)生聚合度為10 左右的寡聚半乳糖醛酸，后者是植物防御反應(yīng)的誘導(dǎo)因子，防御作用包括產(chǎn)生有抗真菌活性的抗毒素，抑制蛋白合成的抑制劑等等，而且當(dāng)endo-PG 與其抑制蛋白結(jié)合以后可進(jìn)一步激活此防御反應(yīng)，所以PG 在植物致病、抗病中具有雙重作用。 某些中草藥中的藥用成分也與果膠成分有關(guān)，如艾草葉中的果膠成分是一種生物活性成分，柴胡根中的抗?jié)兲穷?lèi)與果膠分子中的RG-II有關(guān)，而人參葉中的RG-II也具有抗?jié)冏饔?，柴胡根中的RG-I能夠促進(jìn)鼠B 細(xì)胞產(chǎn)生I L-6，增進(jìn)機(jī)體免疫力，蒼術(shù)根中的果膠片段具有腸道免疫活性。此外，果膠酶解產(chǎn)物還具有抑菌活性，可顯著抑制乳酸菌的生長(zhǎng)；還可作為功能性食品的配料。

2）以幾丁質(zhì)、幾丁聚糖為底物生產(chǎn)低分子寡糖：PG 可水解幾丁質(zhì)、幾丁聚糖的β-(1，4)-糖苷鍵，得到水溶性寡糖。這類(lèi)低分子寡糖具有多方面的生理功能，如抗腫瘤、抗菌、增強(qiáng)免疫機(jī)能，改善腸道微生物區(qū)系的分布，刺激有益菌的生長(zhǎng)等。另外，幾丁寡糖可作為保水劑、抗菌劑、植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑等應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、食品和化妝品業(yè)。

【主要參考資料】

[1] 薛長(zhǎng)湖, et al.果膠及果膠酶研究進(jìn)展. 2005. PhD Thesis.

[2] 賈月, et al. 果膠酶分離純化及分析方法的研究進(jìn)展.工業(yè)微生物, 2005, 35.1: 55-58.

[3] 李琦, et al. 果膠酶應(yīng)用的研究進(jìn)展.中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào), 2014, 30.21: 258-262.