72-19-5 / 大腸桿菌生物合成L-蘇氨酸發(fā)酵條件的優(yōu)化

一、摘要

本文主要闡述采用補料分批發(fā)酵技術提高大腸桿菌TRFC生產L-蘇氨酸的產量。從結果來看，L-蘇氨酸與蔗糖的最佳初始比例為70g/L。

通過利用5L管式發(fā)酵罐進行葡萄糖濃度和三種不同的投料方式對L-蘇氨酸生產的研究。結果表明：葡萄糖濃度在5-20g/L范圍內時，大腸桿菌生長增強。另外C/N比也是影響L-蘇氨酸產量的主要因素。硫酸銨和蔗糖的最佳配比為30g/g。在最優(yōu)發(fā)酵條件下，38h后L-蘇氨酸濃度達到118g/L，產率為3.1g/L/h。（葡萄糖轉化率為46%）。

二、背景

L-蘇氨酸是一種必需氨基酸，添加了L-賴氨酸以提高動物飼料和人類食品的營養(yǎng)價值。L-蘇氨酸的生產主要依賴于大腸桿菌、粘質沙雷氏菌、黃色短桿菌和谷氨酸棒桿菌的營養(yǎng)缺陷型和調節(jié)型突變體以碳水化合物為底物的直接發(fā)酵，通過誘變和基因操作產生的大腸桿菌突變體其生長速度和生理特性而被使用。分離出大腸桿菌HS3，并優(yōu)化碳源（葡萄糖）和氮源（酵母抽提物）的濃度，以提高產蘇氨酸的能力。用玉米漿浸泡液替代酵母提取物作為氮源，通過添加生物素作為生長因子來增加L-蘇氨酸的產量。在發(fā)酵過程中，保持最佳發(fā)酵條件很重要，溫度、通氣量、pH值、水分、碳氮源含量以及培養(yǎng)基的C/N比。作為補料分批發(fā)酵生產L-蘇氨酸的關鍵因素，初始碳源和葡萄糖投料的分析還沒有得到系統(tǒng)研究。

三、主要內容

菌種：大腸桿菌TRFC

培養(yǎng)基：葡萄糖：90 g/L，KH2PO4：2 g/L，（NH4）2SO4：10 g/L，MgSO4:1 g/L,

FeSO4.7H2O:0.01 g/L，MnSO4.4H2O:0.01。

實驗方法：1.將大腸桿菌接種到含有25ml生長因子的500ml三角瓶中，31℃，250rpm下培養(yǎng)11h.根據(jù)實驗的不同目的，接種不同濃度的無菌種子液。2.pH調至6.7，然后接種到500ml 三角瓶中，在37℃下在旋轉搖床上250rpm培養(yǎng)48小時。3.采用5L發(fā)酵罐進行補料分批發(fā)酵，每罐接3L培養(yǎng)基，37℃維持溫度，pH 調至7.0，攪拌設置在500-800rpm之間,溶氧保持在20%以上。4.當初糖耗盡時，使用800g/L葡萄糖溶液作為進料介質，打入發(fā)酵罐中，葡萄糖濃度保持在5-20g/L，當葡萄糖濃度低于5g /L 時，溶解氧會迅速上飄到100%。

①.初始碳源對蘇迅速氨酸的影響：

葡萄糖、半乳糖、山梨糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖各添加90g/L。

大腸桿菌TRFC具有較高的細胞生長率，產生的蘇氨酸比干細胞重，而麥芽糖和乳糖則比蔗糖產量低，加入蔗糖的蘇氨酸的干細胞重量和產量最高。當葡萄糖作為初始碳源時，生物量和蘇氨酸產量最低，可能由于大腸桿菌能吸收糖，并在糖運輸?shù)郊毎罅⒓磫犹墙徒?，氧化磷酸化過程和TCA循環(huán)導致乙酸積累，抑制細胞生長，減少蘇氨酸的產生，但蔗糖作為初始碳源時，它逐漸水解成葡萄糖和果糖，使其對糖酵解具有相對的耐受性、另外，蔗糖相對較低的滲透壓有利于大腸桿菌生產蘇氨酸。

②.蔗糖初始濃度對蘇氨酸的影響：

為了確定生產蘇氨酸的最佳初始蔗糖濃度，用四種不同濃度的蔗糖作為初始濃度：30g /L、50g /L、70g /L、90g /L。當蔗糖耗盡時，將800g/L 蔗糖溶液注入發(fā)酵罐中，知道發(fā)酵罐中總蔗糖濃度達到10g/L。結果顯示，在高初始蔗糖濃度下，蔗糖吸收在培養(yǎng)后期緩慢，13h后開始增加，30g /L和50g /L初始蔗糖濃度要用時9h和10h耗盡，70g /L和90g /L初始蔗糖濃度要用時14.5h和18h耗盡。大腸桿菌TRFC的生長速度，在3g /L0和50g /L比70g /L和90g /L快，由于培養(yǎng)基中有足夠的碳源，干細胞重量在整個培養(yǎng)過程中逐漸增加，但在培養(yǎng)初期增加的速率較高，后期增加速率較低，當蔗糖初始濃度為30g /L時，蘇氨酸的產量在36h達到峰值，但這個峰值明顯低于其他初始蔗糖濃度。表明蘇氨酸的產量由細胞生長速率和最終干細胞重量決定。當蔗糖初始濃度為70g /L和90g /L時，蘇氨酸的產量在整個過程中不斷增加，當蔗糖初始濃度為70g /L時，蘇氨酸的產量最高，在蔗糖初始濃度為70g /L和90g /L的培養(yǎng)基中，高滲透壓對大腸桿菌TRFC有抑制作用，蔗糖的消耗導致滲透壓降低，并導致一定生物量的積累，在一定滲透壓范圍內，較高的蔗糖濃度促進了大腸桿菌生產蘇氨酸，因此最佳初始蔗糖濃度為70g /L。

③.流加方式對生產蘇氨酸的影響:

采用四種補料分批培養(yǎng)法研究補料培養(yǎng)基對蘇氨酸生產的影響，當70g /L的初始蔗糖耗盡時，每隔一段時間向發(fā)酵罐中添加4種不同的碳源，使碳源濃度在10g /L左右，碳源為：蔗糖，葡萄糖、山梨糖、麥芽糖。觀察蘇氨酸的變化，考慮其成本問題最終選擇了葡萄糖作為流加糖。

較高的初始葡萄糖在培養(yǎng)初期會損害微生物的生長，較低的初始葡萄糖濃可以縮短接種后微生物生長的滯后期。

④.葡萄糖濃度和投料方式對生產蘇氨酸的影響。

三種投料方式：1.恒定濃度10g /L左右。2. 5-20g /L。3.0-35g/L 。葡萄糖在培養(yǎng)14-22h消耗較快，24h后消耗較慢，最大耗糖速率在13g /L/h，然后逐漸下降到恒定值。當連續(xù)供應進料培養(yǎng)基以將慘糖保持在10g /L時，其余兩種投料方式保持殘?zhí)欠謩e在5-20g /L和0-35g /L范圍內振蕩，20h最大耗糖速率為13.9g /L/h。21h最大耗糖速率為12.8g /L/h。5-20g /L投料方式對葡萄糖的消耗能力最強。

不同投料方式獲得蘇氨酸產量（5.6g /L/h、6.0g /L/h、5.3g /L/h）的時間約為21h，與最大耗糖速率相對應。在38h時，蘇氨酸的最高產量為（103g /L、90.2g /L、94.1g /L），與連續(xù)投加相比，生產和使用成本都有較大提高。

⑤.C/N比對蘇氨酸產量的影響:

硫酸銨和酵母提取物分別是生產蘇氨酸的最佳無機氮源和有機氮源，對于發(fā)酵結束時細胞密度和所需產物濃度的增加，C/N比比氮源濃度更重要，有C/N比培養(yǎng)基，在5L發(fā)酵罐中進行補料分批發(fā)酵，考察C/N比對蘇氨酸的影響。通過添加硫酸銨將C/N比分別調整為10、15、30、50。發(fā)現(xiàn)硫酸銨與蔗糖的最佳配比為30，培養(yǎng)38h后，蘇氨酸最終產量為118g /L，干細胞重量為27.4g /L產率為3.1g /L/h。

總結：

蔗糖初始濃度為70g /L、C/N比為30，間歇投加800g /L葡萄糖，以維持殘?zhí)窃?-20g /L范圍內，發(fā)酵38h，蘇氨酸濃度為118g /L/h。轉化率為46%，產率為3.1g /L/h。