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乳清酸，即6-羧基尿嘧啶，也稱維生素B13，主要存在于根莖類蔬菜、乳漿、酸奶或煉乳的液態(tài)部分。在60年代，乳清酸用于治療黃膽和一般肝臟機(jī)能障礙，近年來雖然漸漸被新藥代替，但在改善肝功能，促進(jìn)肝細(xì)胞的修復(fù)以及其它方面仍然發(fā)揮作用，如：乳清酸可治療痛風(fēng)病，改進(jìn)腦血管循環(huán)，增加吞噬細(xì)胞活性，提高組織再生能力，有助于治愈傷口。另外，乳清酸還可用于免疫輔藥，可以治療慢性X線中毒，作為化學(xué)品中毒的預(yù)防劑和治療劑。
乳清酸類藥物以其療效好、副作用小、對腎臟無刺激，體內(nèi)殘留和積累量低等特點(diǎn)備受青睞與關(guān)注。近年來開發(fā)研究出乳清酸用于核酸的合成，而核酸是生命的主要物質(zhì)，對于研究蛋白質(zhì)的生物合成以及人類遺傳學(xué)都具有非常重要的意義。目前已經(jīng)開發(fā)出以乳清酸為原料生產(chǎn)的核酸類保健食品與藥物，能影響和控制許多生命代謝活動，對延緩人體衰老具有明顯效果。
步驟一、以濃硫酸為催化劑制備馬來酰脲
取4000g甲苯，1000g順丁烯二酸酐和1300g尿素，以98％(質(zhì)量百分比)濃硫酸(用量為100g)為催化劑，在70℃條件下，反應(yīng)1小時，過濾、洗滌、烘干制得馬來酰脲，產(chǎn)品純度為80％，收率為85％。
按照上述實驗方法，實驗人員又進(jìn)行了4-6次馬來酰脲的制備，反應(yīng)時間為1-3小時，結(jié)果產(chǎn)品的純度為75％－88％，收率為80％-90％。
馬來酰脲的檢測方法：
HPLC方法檢測純度：
流動相：0.02M KH2PO4(pH2.5)，加0.005M四丁基溴化銨：乙腈(95：5)
進(jìn)樣體積：10ul
柱溫：25℃
流速：1.0ml/min
色譜柱：Kromasil Eternity-5-c18,4.6×250mm
馬來酰脲主峰出峰時間在6.6min左右。
步驟二、制備粗品乳清酸
取500g馬來酰脲，溴(馬來酰脲與溴的質(zhì)量比為1:1.5)和3000g水，在20℃條件下反應(yīng)10h制得溴代物中間體。取10％的氫氧化鈉溶液1L，加熱到60℃，然后將溴代物中間體倒入該熱堿溶液中，控溫在60℃，攪拌反應(yīng)5h得澄清溶液。然后用濃鹽酸(市售的)調(diào)節(jié)反應(yīng)液至pH為1，得到固體析出，經(jīng)過濾、洗滌、烘干得粗品乳清酸，產(chǎn)品純度96％，產(chǎn)品收率80％。
按照上述實驗方法，實驗人員又進(jìn)行了4-6次乳清酸的制備。其中，馬來酰脲與溴的質(zhì)量比為1:1.5-3.0，馬來酰脲與溴的反應(yīng)溫度為5-20℃，反應(yīng)時間為10-25h；10％氫氧化鈉溶液的使用量1-2L，將溴代物倒入時溫度維持在55-85℃；攪拌時間為5-10h。結(jié)果乳清酸產(chǎn)品純度90％-96％，產(chǎn)品收率72％-90％。
粗品乳清酸的檢測方法：
HPLC方法檢測純度：
流動相：0.02M KH2PO4(pH2.5)，加0.005M四丁基溴化銨：乙腈(95：5)
進(jìn)樣體積：10ul
柱溫：25℃
流速：1.0ml/min
色譜柱：Kromasil Eternity-5-c18,4.6×250mm
粗品乳清酸出峰時間在12min左右。
該制備方法中，無需將溴代的中間產(chǎn)物進(jìn)行任何后處理，而是直接將該含有該溴代的中間產(chǎn)物的反應(yīng)混合物加入到熱的堿性溶液中，簡化了操作步驟(尤其是過濾步驟)，大大地減少了溴對操作人員的健康傷害，且減少了溴代的中間產(chǎn)物的損失，從而有效地提高了最終產(chǎn)品的收率。
步驟三、乳清酸粗品精制
取150g粗品乳清酸，去離子水(用量為1000g)，在60℃條件下進(jìn)行攪拌，溶液體系呈白色乳狀；然后在該體系下滴加氨水100g，攪拌反應(yīng)3h。過濾，取得濾液，用鹽酸酸化至pH為1，攪拌冷卻至室溫過濾，水洗，收集固體，干燥得一水乳清酸產(chǎn)品，產(chǎn)品純度96％，收率為70％。
按照上述實驗方法，實驗人員又進(jìn)行了4-6次乳清酸的精制。其中，第一次氨水用量為100-300g，攪拌溫度為55-85℃，攪拌時間為3-5h，第二次氨水用量為100-300g，攪拌反應(yīng)3-5h。結(jié)果得到一水乳清酸產(chǎn)品產(chǎn)品純度≥96％，收率為65％-85％。
乳清酸成品的檢測方法：
HPLC方法檢測純度：
流動相：0.02M KH2PO4(pH2.5)，加0.005M四丁基溴化銨：乙腈(95：5)
進(jìn)樣體積：10ul
柱溫：25℃
流速：1.0ml/min
色譜柱：Kromasil Eternity-5-c18,4.6×250mm
乳清酸出峰時間在12min左右。
下圖為乳清酸的DSC譜圖。
乳清酸的制備方法，其具體步驟如下：
(1)氨甲酰天冬氨酸的合成：在反應(yīng)容器中加入天冬氨酸39.9g，再加入21g氰酸鈉，然后加入水119.7毫升，在75℃反應(yīng)4.5小時，自然冷卻后加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)是38％的濃鹽酸至pH為2.3，析出氨甲酰天冬氨酸，過濾，烘干，得產(chǎn)品28.5g，收率65％。
(2)乙內(nèi)酰脲基代醋酸的合成：在反應(yīng)容器中，加入氨甲酰天冬氨酸28.5g，加入20wt％鹽酸85毫升，加熱蒸發(fā)至干，殘留物在水中重結(jié)晶，過濾得到濾渣，將濾渣烘干得乙內(nèi)酰脲基代醋酸22.8g，收率76％。
(3)羧基甲基乙內(nèi)酰脲的合成：在反應(yīng)容器中，加入22.8g乙內(nèi)酰脲基代醋酸，再加入11.4mL液溴，然后加入45.6毫升冰醋酸，在100℃加熱2小時。在15分鐘內(nèi)將懸浮物倒入150毫升沸水中，冷卻結(jié)晶，過濾得到濾渣，將濾渣在100-105℃烘干，得到羧基甲基乙內(nèi)酰脲15.9g，收率73％。
(4)乳清酸的合成：在反應(yīng)容器中加入羧基甲基乙內(nèi)酰脲15.9g，加入20wt％氫氧化鈉31.8毫升，以每分鐘5℃的升溫幅度升溫到65℃，保溫15分鐘，加入2.5g活性炭脫色，過濾，濾液用鹽酸酸化至pH4.5，在30轉(zhuǎn)/min的條件下攪拌半小時，冷卻，過濾，烘干得乳清酸11.2g，收率68％。
[1][中國發(fā)明]CN201610156748.X一種制備乳清酸的方法
[2][中國發(fā)明]CN201510016242.4一種乳清酸的制備方法