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牛血清白蛋白BSA（Bovine Serum Albumin，BSA）大概是生化實(shí)驗(yàn)室最為常見、應(yīng)用最為廣泛的蛋白質(zhì)了。雖然小小的BSA并不那么起眼，但是在生化實(shí)驗(yàn)當(dāng)中，卻常常扮演十分關(guān)鍵的角色。
BSA前體蛋白全長607個氨基酸。前體蛋白從N端脫去18個信號肽，以及6個前肽，形成含有583個氨基酸、分子量約為66.5kDa的成熟BSA蛋白。
由于BSA酸性氨基酸數(shù)量要多于堿性氨基酸，其等電點(diǎn)約為4.7。BSA在溶液中的表面電荷（Zeta potential）受到溶液pH的影響。當(dāng)pH大于等電點(diǎn)時BSA帶負(fù)電，小于等電點(diǎn)時BSA帶正電。
△BSA表面電荷于pH之間的關(guān)系（BSA濃度為15mg/mL）
另外pH還會影響到BSA在水溶液中的分子尺寸。當(dāng)BSA溶液pH從7.0下降到4.7，等電點(diǎn)附近時，BSA分子尺寸沒有明顯的變化，但是，當(dāng)pH從4.7下降至3.0時，BSA在水溶液中的粒徑從10nm左右，增加到12.5nm左右。一個可能的原因是，BSA的堿性氨基酸大多數(shù)分布在分子內(nèi)測，當(dāng)溶液pH小于BSA等電點(diǎn)，堿性氨基酸開始電離，暴露在BSA蛋白質(zhì)表面。另外，出于同樣原因，當(dāng)溶液pH降低，BSA的內(nèi)部疏水基團(tuán)也會隨之暴露在蛋白表面，而使BSA變得更為疏水。
BSA的應(yīng)用非常廣泛。在生化實(shí)驗(yàn)中，常將BSA用于維持蛋白穩(wěn)定性，以及ELISA實(shí)驗(yàn)、western blot，以及磁免疫檢測中的固相封閉。
當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)處于“壓力”的狀態(tài)下，如加熱、紫外照射、氧化、剪切力等，蛋白質(zhì)的空間折疊趨于延展，導(dǎo)致內(nèi)部疏水位點(diǎn)暴露，發(fā)生無定形聚集或者形成高結(jié)構(gòu)化的淀粉樣蛋白，從而失去生物活性。BSA具有良好的熱穩(wěn)定性，當(dāng)溫度上升至65度時，其空間結(jié)構(gòu)的變化依然是可逆的。BSA另一個特點(diǎn)是能夠和許多物質(zhì)形成可逆結(jié)合，特別是水溶性較差的物質(zhì)，如脂肪酸、血紅素、膽紅素、帶負(fù)電荷的芳香化合物等，能夠增加其水溶性。因此，BSA是理想的蛋白保護(hù)劑。當(dāng)酶、或抗體等蛋白質(zhì)發(fā)生空間結(jié)構(gòu)變化，BSA能夠與其發(fā)生可逆結(jié)合，形成穩(wěn)定的、可溶的高分子復(fù)合物，防止蛋白發(fā)生無定形聚集。另外，溶液中的BSA能夠與容器表面結(jié)合，防止蛋白吸附在容器表面而濃度降低。
如1995年Chang等人發(fā)現(xiàn)，蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性是由蛋白表面的疏水性決定的。當(dāng)溫度升高時，酶的疏水位點(diǎn)暴露，溶液中的BSA與酶的疏水區(qū)域結(jié)合，從而維持酶的水溶性，防止發(fā)生聚集，有效提高酶的熱穩(wěn)定性。并且，疏水性越強(qiáng)的保護(hù)蛋白，對酶的保護(hù)作用越強(qiáng)。
在免疫檢測過程中，需要將抗體固定在固相表面，如微孔板，磁顆粒、聚苯乙烯微球或硝酸纖維膜表面。由于蛋白是一種粘性較大的分子，檢測過程中，樣本中的雜蛋白會與固相表面的疏水位點(diǎn)發(fā)生非特異性結(jié)合，造成背景干擾。因此，需要將固相表面的多余位點(diǎn)用封閉劑將其封閉，常用的封閉劑，如BSA、酪蛋白、明膠等能夠吸附在固相表面，防止抗體、或者抗原與固相表面發(fā)生非特異性結(jié)合，降低檢測本底，提高靈敏度。
BSA是一種球蛋白，分子量約為66.5kDa，表面含有大量的氨基和羧基殘基，并且BSA的空間結(jié)構(gòu)能夠隨著溫度、pH、鹽濃度發(fā)生變化，是一種柔性分子。作為常見的封閉蛋白，BSA能夠與親水表面、疏水表面，以及活化的共價結(jié)合表面，如活化羧基、氨基、環(huán)氧基、甲苯磺酰基等結(jié)合，抑制非特異性吸附，是一種理想的固相封閉劑。
BSA表面含有大量的羧基、氨基，能夠用于表面的活化基團(tuán)結(jié)合，封閉多余位點(diǎn)，最為常見的是化學(xué)發(fā)光免疫磁珠偶聯(lián)抗體當(dāng)中的應(yīng)用。如用EDC活化羧基表面磁珠后，能夠和抗體表面氨基反應(yīng)，使抗體共價結(jié)合在磁珠表面。這一過程需要對多余的活化羧基位點(diǎn)進(jìn)行封閉，BSA分子尺寸更小，能夠進(jìn)入到表面抗體間的間隙，并且由于表面含有大量的氨基，與活化羧基反應(yīng)，封閉多余的活性位點(diǎn)。同時，BSA表面含有大量的羧基，還能夠改善磁珠的親水性。另外，BSA表面含有一定的氨基酸疏水殘基，如丙氨酸、亮氨酸等，也能夠?qū)Ρ砻娴氖杷稽c(diǎn)進(jìn)行封閉。
值得注意的是，Larsericsdotter等人研究發(fā)現(xiàn)，BSA在磷酸鹽溶液中，在固相表面吸附更為緊湊，形成的結(jié)構(gòu)也更為穩(wěn)定。這是因?yàn)?，磷酸鹽與BSA上的甘氨酸和精氨酸結(jié)合，能夠消除結(jié)構(gòu)性靜電排斥。因此BSA在磷酸緩沖液中結(jié)構(gòu)更為穩(wěn)定，在固相表面具有更高的結(jié)合效率。
采用BSA作為穩(wěn)定劑和封閉劑一個最大的問題是批次之間的差異。作為生物來源的蛋白質(zhì)，不同廠家的BSA規(guī)格不一致，同一廠家，不同批次之間的差異，都會給實(shí)驗(yàn)結(jié)果帶來巨大的差異。為了保證實(shí)驗(yàn)的一致性，國內(nèi)大多數(shù)廠家都選用進(jìn)口的BSA，如Biowest，Sigma，Thermofisher，Merck，Bovogen，Proliant等。
同時不少廠家都推出了無蛋白穩(wěn)定劑，以及化學(xué)合成的封閉劑，作為BSA替代。如Synblock系列，以及JSR推出的Blockmaster系列等。其中JSR公司利用獨(dú)有技術(shù)，開發(fā)了一系列的聚合物型封閉劑，適用于磁珠封閉。CE510/CE210采用生物相容性極高的柔性分子聚乙二醇（PEG）作為骨架，在PEG一端修飾一段寡氨，能夠和磁珠表面活化的羧基、或者疏水位點(diǎn)發(fā)生反應(yīng)，固定在磁珠表面，從而起到封閉的作用。同時，由于PEG是極強(qiáng)的親水性柔性大分子，能夠增加磁珠表面的水化層，有效降低磁珠的沉降速率，并且對表面修飾的抗體起到支撐作用。
BSA除了能夠用作蛋白穩(wěn)定劑、固相封閉劑之外，還可以作為小分子的載體，如通過把熒光分子修飾在BSA表面，再將熒光-BSA與抗體偶聯(lián)，在增加熒光強(qiáng)度的同時，避免由于抗體的過度修飾而導(dǎo)致抗體失活。
BSA是生化實(shí)驗(yàn)室最常用的蛋白之一，而實(shí)驗(yàn)中，可能因?yàn)樗^于常見、過于平凡而忽略了它的重要性。本文對BSA的分子結(jié)構(gòu)，氨基酸數(shù)目，以及BSA維持熱穩(wěn)定性功能，免疫檢測封閉功能進(jìn)行了基本的描述。如何選擇合適的BSA，如何設(shè)定BSA的質(zhì)控，以及如何最大程度的發(fā)揮BSA的性能，對于一個實(shí)驗(yàn)室來說也是一個大的課題。