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牛血清白蛋白是含581個氨基酸殘基的多肽，理論計算的分子量為68kD，等電點為4.8。含氮量16％，含糖量0.08％，僅含己糖和己糖胺，含脂量只有0.2％。它由581個氨基酸殘基組成，其中35個半胱氨酸組成17個二硫鍵，使分子呈9段彎曲，形成3個等體積的球狀，在肽鏈的第34位有一自由巰基。牛血清白蛋白可與多種陽離子、陰離子和其他小分子物質(zhì)結合。牛乳總蛋白中有1％-2％的蛋白為牛血清白蛋白，通過細胞間結合處進入牛乳，不具有特殊生理功能，但在乳成分分析檢測領域中有重要作用。牛血清白蛋白在牛血液中約占50％，血液中的牛血清白蛋白主要起維持滲透壓作用、PH緩沖作用、載體作用和營養(yǎng)作用。
牛血清白蛋白提取方法，包括以下步驟：
取新鮮的牛血液6000毫升，加入667毫升38％的檸檬酸三鈉，使檸檬酸三鈉在牛血液中的終重量濃度為3.8％，然后通過血球分離機(GFX-105血液分離機、遼陽翔隆制藥機械有限公司)，對牛血液進行分離(轉(zhuǎn)速16300rpm/min)，分離得到血細胞和血漿。
2.1取步驟1中的血漿4000毫升，加入6000毫升的飽和硫酸銨，使硫酸銨在血漿中的終濃度為60％，并攪拌1h，使血漿中的蛋白質(zhì)沉淀，去除上清液，保留蛋白沉淀。
2.2按與蛋白沉淀的質(zhì)量比為5:1的比例加入超純水6000毫升，溶解上述蛋白沉淀，得到蛋白溶解液7000毫升。
通過超濾機對步驟2.2中得到蛋白溶解液進行超濾濃縮，超濾機上所用超濾膜包的超濾膜的截留分子量為5KD，調(diào)節(jié)超濾機的參數(shù)(MiniPellicon超濾系統(tǒng)、merkmillipore公司)，流速為400ml/min、跨膜壓為0.1psi，濃縮10倍，同時，用20mM、pH7.0的磷酸鈉緩沖液進行換液。即用恒流泵將第一磷酸鹽緩沖液加入到正在濃縮過程中的蛋白溶解液中，并通過恒流泵控制第一磷酸鹽緩沖液的流速使蛋白溶解液的體積維持穩(wěn)定，得到蛋白濃縮液700毫升。
用層析純化儀(APPSMV100D、利穗(蘇州)科技有限公司)對上述蛋白濃縮液進行層析純化，以二乙基氨基乙基-纖維素(二乙基氨基乙基離子交換介質(zhì))作為層析柱填料。上柱前，用20mM、pH7.0的磷酸鈉緩沖液平衡，流速10ml/min，平衡體積5CV；平衡結束后，將蛋白濃縮液上柱層析，控制流速8ml/min；上樣結束后，用平衡液平衡5CV，流速為10ml/min；用含1mol/L氯化鈉的20mM、pH7.0的磷酸鹽緩沖液進行梯度洗脫(從0％B到100％B拉梯度洗脫，共10CV)，收集得到粗白蛋白溶液400ml毫升。洗脫后，用2mol/L的氯化鈉溶液對層析柱進行再生處理。
通過超濾機對步驟4中得到粗白蛋白溶液進行超濾濃縮，超濾機上所用超濾膜包的超濾膜的截留分子量為5KD，調(diào)節(jié)超濾系統(tǒng)的參數(shù)，流速為400ml/min、跨膜壓為0.1psi，用20mM、pH5.0的檸檬酸鈉緩沖液進行換液。得到粗蛋白液600毫升。
用層析純化儀對上述粗蛋白濃縮液層析純化，以磺丙基-纖維素(磺丙基離子交換介質(zhì))作為層析柱填料。上柱前，用20mM、pH5.0的檸檬酸鈉緩沖液平衡，流速6ml/min，平衡體積10CV；平衡結束后，將蛋白濃縮液上柱層析，流速4ml/min，直接收集流出液，得到高純度的低雜質(zhì)含量的牛血清白蛋白溶液1000ml毫升。經(jīng)冷凍干燥后記得到牛血清白蛋白粉。
單獨使用硅藻土純化牛血清白蛋白
用硅藻土純化牛血清白蛋白(去除牛血清白蛋白中的核酸酶)時，使用的懸浮液為Tris-HCl緩沖溶液，濃度為50mM，pH為7.8；使用的透析液為Tris-HCl緩沖溶液，濃度為10mM，pH為8.0；硅藻土以及懸浮液使用前在121℃條件下滅菌30min。具體的純化步驟為：
(1)將6g硅藻土用60mL懸浮液(硅藻土與懸浮液的比例為1:10w/v)混合，置于100℃沸水浴中5min，室溫條件下攪拌5min，5000rpm離心10min，丟棄上清液；重復上述洗滌步驟3次后，將洗滌后的硅藻土在60mL懸浮液中分散均勻，得到吸附劑分散液，在4℃條件下儲存?zhèn)溆茫?/p>
(2)將2.5g牛血清白蛋白在12.5mL懸浮液中(牛血清白蛋白與懸浮液的比例為1:5w/v)溶解分散均勻，加入18.75mL吸附劑分散液，在4℃攪拌30min后，在該溫度下10000rpm離心10min，收集上清；
(3)在上清液中加入18.75mL吸附劑分散液(牛血清白蛋白懸浮液與吸附劑分散液的比例為1:1.5v/v)，在4℃攪拌30min，在該溫度10000rpm離心10min，收集上清液；再重復一次；
(4)收集的上清用0.45μm膜過濾后，即得牛血清白蛋白純化液；
(5)采用分子截留量為10KD的超濾濃縮管2500rpm離心20min，對蛋白濃度進行超濾濃縮，得到超濾牛血清白蛋白樣品；
(6)將超濾牛血清白蛋白樣品采用分子截留量為14000Da的透析袋4℃條件下攪拌透析2h后，更換透析液透析過夜，超濾牛血清白蛋白樣品與透析液的體積比為1:15；
(7)透析后的樣品測定蛋白濃度后，稀釋至10mg/ml，分裝成1mL/支，保存于-20℃。
一種制備牛血清白蛋白納米微球的方法，其步驟包括：
（1）配制濃度為10mM的氯化鈉水溶液，將100牛血清白蛋白溶解于5ml氯化鈉溶液，
（2）將4mg雙端馬來酰亞胺化聚乙二醇溶解于1ml氯化鈉溶液中，氬氣保護下滴加到牛血清白蛋白溶液中，室溫下攪拌2小時，
（3）室溫攪拌下滴加濃度為1N的氫氧化鈉溶液，調(diào)節(jié)混合溶液pH值為7，
（4）室溫攪拌下滴加6倍體積的丙酮或乙醇，至溶液混濁；
（5）高速離心得到納米微球，隨后分別用蒸餾水、無水乙醇清洗，最后冷凍干燥得到牛血清白蛋白納米微球。
檢測牛乳中牛血清白蛋白含量的方法包括如下步驟：
(a)配制標準溶液，制訂標準曲線：
將牛血清白蛋白標準品溶于樣品緩沖液，配制濃度分別為4mg/ml、2mg/ml、1mg/ml、0.5mg/ml、0.01mg/ml的標準溶液。精確提取40μl標準溶液加入樣品管中，超聲波清洗3min后使用高壓毛細管電泳分析儀分析。積分后的峰面積分別為57568、29684、15481、7125、148，利用軟件得出標準曲線，線性回歸相關系數(shù)為0.9993，最低檢出限為0.1ng，最低檢出含量為0.01mg/ml，標準樣品回收率達90％。
(b)檢測待測牛乳：
把奶樣品加入15ml的離心管中，在5000r/min離心條件下離心10min，離心溫度為4℃，然后準確提取100μl置于2ml離心管中(或其他容器)，提取400μl樣品緩沖液加入2ml離心管中稀釋5倍，使用漩渦混合器混勻。精確提取40μl上述處理樣品加入樣品管中，放置于超聲波清洗機3min，之后使用高壓毛細管電泳分析儀測定。
上述步驟(a)和(b)中，處理樣品緩沖液配置方法：在1體積份150mmol/L的三甲基氨基甲烷緩沖液中加入4體積份50mmol/L的乙二胺四乙酸二鈉、4體積份5mol/L的尿素、4體積份2mg/ml的二硫基蘇糖醇、4體積份0.03％的甲基羥乙基纖維素，使用氫氧化鈉溶液把pH值調(diào)至8.5。
上述步驟(a)和(b)中，高壓毛細管電泳分析儀的電泳溫度控制在35℃，使用直徑為50μm、長度為200mm的涂層石英毛細管柱，紫外線檢測器，壓力進樣，壓力為0.5psi，時間為10s，分離溫度為15℃，工作電壓為17kV。
上述步驟(a)和(b)中，電泳緩沖液的配置方法：檸檬酸緩沖液，pH值為3.0。
(c)樣品定量讀數(shù)：
根據(jù)樣品分離的圖譜，運用高壓毛細管電泳分析儀所帶的分析軟件，積分牛血清白蛋白的峰面積為1035，利用分析軟件自動套入標準曲線方程內(nèi)計算出試樣濃度為0.067mg/ml，再乘稀釋倍數(shù)5，即得實際濃度為0.335mg/ml，所以該牛奶樣品含有的牛血清白蛋白濃度為0.335g/L。
[1][中國發(fā)明,中國發(fā)明授權]CN201810839672.X一種制備分子生物級牛血清白蛋白的方法
[2][中國發(fā)明]CN201310687518.2一種牛血清白蛋白納米微球的制備方法
[3][中國發(fā)明]CN201010134403.7一種檢測牛乳中牛血清白蛋白含量的方法
[4][中國發(fā)明]CN201610715134.0一種牛血清白蛋白提取方法和牛血清白蛋白