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N-芐氧羰基-L-精氨酸是重要的醫(yī)藥中間體，L-精氨酸與芐氧羰基氯在堿性作用下進(jìn)行親核反應(yīng)合成多肽中間體 N-芐氧羰基-L-精氨酸，此合成路線簡(jiǎn)單，引入了相轉(zhuǎn)移催化劑和縛酸劑后產(chǎn)品收率和品質(zhì)都有較大的提升和改善。
L-精氨酸具有胍基、羧基和氨基，這些官能團(tuán)使其在生理生化功能上展現(xiàn)了非常重要和多元化的作用，同時(shí)也是精氨酸衍生化的化學(xué)結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。其中，胍基是一種堿性基團(tuán)，易于水解，可被取代，其中的碳氮雙鍵有一定的還原性，可被氧化；羧基是一種弱酸性基團(tuán)，可與游離氨基發(fā)生酰胺反應(yīng)，也可脫離生成二氧化碳；氨基是一個(gè)高活性、易被氧化的手性堿性基團(tuán)，可參與酰胺類物質(zhì)和酮的生成以及消旋反應(yīng)。此外，L-精氨酸主鏈碳原子不活潑，但其上氫原子可被羥基取代。
L-精氨酸 (L-arginine, L-Arg) 是一種堿性半必需氨基酸，于 1886 年從羽扇豆幼苗中發(fā)現(xiàn)，其在動(dòng)植物體內(nèi)具有重要的生理活性 (促進(jìn)肝功能恢復(fù)、減緩血栓形成、減輕神經(jīng)衰弱、促進(jìn)傷口恢復(fù)等)，在化工、食品和醫(yī)藥等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用。
目前，L-精氨酸的生產(chǎn)途徑包括化學(xué)提取法和微生物發(fā)酵法?；瘜W(xué)提取法主要是指利用精細(xì)化工的手段，從包括自然資源及有機(jī)廢液的蛋白質(zhì)產(chǎn)物中直接提取 L-精氨酸，主要包括沉淀法、電滲析法和離子交換法，是早期生產(chǎn) L-精氨酸所采用的主流方法。微生物發(fā)酵法以其環(huán)境友好、生產(chǎn)條件溫和和生產(chǎn)過(guò)程穩(wěn)定的優(yōu)勢(shì)，逐漸在 L-精氨酸的生產(chǎn)中占據(jù)主導(dǎo)地位。特別是通過(guò)傳統(tǒng)菌株篩選、代謝工程改造及生物反應(yīng)器發(fā)酵過(guò)程優(yōu)化等手段，微生物發(fā)酵法生產(chǎn) L-精氨酸在過(guò)去幾十年里取得了長(zhǎng)足的進(jìn)展，為 L-精氨酸的高值化生產(chǎn)提供了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。生產(chǎn) L-精氨酸的常用菌株有鈍齒棒桿菌 Corynebacterium crenatum、黃色短桿菌Brevibacterium flavum 和 谷 氨 酸 棒 桿 菌Corynebacterium glutamicum 等。
L-精氨酸與芐氧羰基氯在堿性作用下進(jìn)行親核反應(yīng)合成多肽中間體 N-芐氧羰基-L-精氨酸。其合成反應(yīng)式見(jiàn)下圖。
圖1 N-芐氧羰基-L-精氨酸的合成反應(yīng)式
將 L-精氨酸 26. 25 g(0. 25 mol)、4 mol/L 氫氧化鈉溶液 62. 5 mL(0. 25 mol)加入裝有機(jī)械攪拌、溫度計(jì)、酸度計(jì)、滴加瓶的500 mL 四口燒瓶中，在冷阱中開(kāi)啟攪拌，使精氨酸和氫氧化鈉反應(yīng)完全，向四口燒瓶中加入 2.7 g 四丁基硫酸氫銨和 50 mL 水?dāng)嚢枋瓜噢D(zhuǎn)移催化劑溶解，0 ℃ 以下緩慢滴加芐氧羰基氯 42. 5 mL(0. 3 mol)，后期不斷滴加 pH =9 的硼酸緩沖溶液調(diào)節(jié) pH 保持在 9 左右。芐氧羰基氯滴完后將溫度升至15 ℃，繼續(xù)攪拌反應(yīng)3 h，TLC 檢測(cè)反應(yīng)完全。用乙醚洗滌(2 ×20 mL)，醚層棄去。不斷攪拌下緩慢滴加 6 mol/L 鹽酸，調(diào)節(jié)水相 pH =2，繼續(xù)攪拌 20 min，析出白色固體。乙酸乙酯萃取(3×30 mL)，分出乙酸乙酯有機(jī)層。用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%氯化鈉溶液和水洗至中性，無(wú)水硫酸鈉干燥，旋蒸除乙酸乙酯，得油狀液體。置于冰箱冷凍過(guò)夜，油狀液體析出大量白色固體，加入大量石油醚，攪拌得白色粉末狀固體。抽濾，用石油醚洗滌、干燥，得N-芐氧羰基-L-精氨酸 55. 56 g。
以不同條件下 N-芐氧羰基-L-精氨酸的收率為基準(zhǔn)，采用正交實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行分析研究。實(shí)驗(yàn)組反應(yīng)時(shí)間都為3 h。選擇主要因素為反應(yīng)溫度(A)、pH(B)、n(L-精氨酸)∶n(氯甲酸芐酯)(C)、相轉(zhuǎn)移催化劑(D)，進(jìn)行了四因素三水平的正交實(shí)驗(yàn)，結(jié)果可知，4 個(gè)影響 N-芐氧羰基-L-精氨酸合成的因素中反應(yīng)溫度對(duì)合成的影響最為明顯，適宜的反應(yīng)條件是反應(yīng)溫度 15 ℃，pH =9，n(L-精氨酸)∶n(氯甲酸芐酯)=1∶1. 2，相轉(zhuǎn)移催化劑添加 2.7 g，在此條件下制備N-芐氧羰基-L-精氨酸。
L-精氨酸鈉鹽與芐氧羰基氯的反應(yīng)屬于兩相反應(yīng)，四丁基硫酸氫銨作為相轉(zhuǎn)移催化劑的機(jī)理是攜帶芐氧羰基氯由有機(jī)相進(jìn)入無(wú)機(jī)相，四丁基硫酸氫銨起類似載體作用。生成的 N-芐氧羰基-L-精氨酸又進(jìn)入有機(jī)相使反應(yīng)更徹底，因此，在正交實(shí)驗(yàn)中添加了相轉(zhuǎn)移催化劑作為一個(gè)影響因素考察了其對(duì) N-芐氧羰基-L-精氨酸收率的影響。添加相轉(zhuǎn)移催化劑的實(shí)驗(yàn)組中 N-芐氧羰基-L-精氨酸收率要高于未添加相轉(zhuǎn)移催化劑的實(shí)驗(yàn)組的收率，由此可見(jiàn)，添加相轉(zhuǎn)移催化劑可以明顯促進(jìn)反應(yīng)的進(jìn)行。
N-芐氧羰基-L-精氨酸與溴化芐的反應(yīng)為親核取代，選擇 DMF 作為反應(yīng)溶劑，因反應(yīng)生成大量的氫溴酸，加入縛酸劑可以及時(shí)除去氫溴酸促使反應(yīng)向正向反應(yīng)進(jìn)行。分別考察了在無(wú)縛酸劑、碳酸氫鈉、碳酸鉀、氫氧化鈉、吡啶、三乙胺作為縛酸劑條件下對(duì) N-芐氧羰基-L-精氨酸芐酯產(chǎn)率的影響，結(jié)果可以看出，使用有機(jī)堿的效果要遠(yuǎn)遠(yuǎn)好于無(wú)機(jī)堿，這可能是與有機(jī)堿溶劑在 DMF 中呈均相而無(wú)機(jī)堿不溶于 DMF 呈非均相體系有關(guān)。另外，三乙胺也可以作為催化劑起到催化溴化芐與 N-芐氧羰基-L-精氨酸合成的作用。兩種有機(jī)堿的縛酸效果為:三乙胺 ＞ 吡啶，推測(cè)有機(jī)堿的堿性大小起關(guān)鍵作用。所以最終根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果選擇三乙胺作為 N-芐氧羰基-L-精氨酸芐酯合成的縛酸劑。
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