460-39-9 / 3,3,3-三氟丙胺的制備

背景及概述^[1][2]

手性胺在醫(yī)藥、農(nóng)藥和化學(xué)產(chǎn)業(yè)中起到非常重要的作用，它們通常作為中間體或合成單體用于制備各種諸如藥物活性物質(zhì)的生理活性物質(zhì)，例如頭孢菌素或吡咯烷衍生物等為數(shù)眾多的手性胺的各種應(yīng)用中，只有一種特定的光學(xué)活性形式，即（R）或（S）對(duì)映體是有生理活性的。

合成3,3,3-三氟丙胺類化合物的化學(xué)方法主要有采用三氟化試劑直接對(duì)胺類底物引入三氟基團(tuán)。然而，三氟化試劑如C6H5SCF3等比較昂貴，且難以制備；而3,3,3-三氟丙胺底物不穩(wěn)定、易分解，在反應(yīng)過(guò)程中容易水解，所以上述化學(xué)合成方法，不適合放大實(shí)驗(yàn)和產(chǎn)業(yè)化。與傳統(tǒng)的化學(xué)合成方法相比，酶法通常使用更為溫和的條件，并且能夠獲得合理的立體選擇性。但是，通常使用的酶底物特異性、對(duì)映體選擇性和/或轉(zhuǎn)化率對(duì)于工業(yè)化的生產(chǎn)過(guò)程還不夠高。另外，使用轉(zhuǎn)氨酶生產(chǎn)光學(xué)活性胺的一個(gè)最主要的缺陷是常常會(huì)發(fā)生底物和產(chǎn)物抑制現(xiàn)象。

根據(jù)PFAM數(shù)據(jù)庫(kù)中的多序列比對(duì)，3,3,3-三氟丙胺的轉(zhuǎn)氨酶可以被分為5類：天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶、芳香族轉(zhuǎn)氨酶、ω-轉(zhuǎn)氨酶、支鏈轉(zhuǎn)氨酶和D-轉(zhuǎn)氨酶。由于ω-轉(zhuǎn)氨酶可以催化一些特定的底物，因此具有更好的工業(yè)應(yīng)用價(jià)值。

3,3,3-三氟丙胺

制備^[2]

將帶有重組質(zhì)粒pET-28a-ω-opt-TA的重組工程菌接種到20mL含有50μg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、180rpm振蕩過(guò)夜培養(yǎng)，然后以1%的接種量接種到含有50μg/mL卡那霉素的100mLLB液體培養(yǎng)基，37℃、180rpm培養(yǎng)至OD600為0.6～0.8時(shí)，加入IPTG（終濃度為1mmol/L），25℃、150rpm繼續(xù)誘導(dǎo)18h。誘導(dǎo)結(jié)束后，4℃下4000×g離心10min，收集菌體沉淀。用pH8.0、0.1mol/L的磷酸緩沖液洗滌兩次，除盡培養(yǎng)基后再用原發(fā)酵液體積1/10的破胞緩沖液重懸細(xì)胞，在冰浴中超聲破胞90次（300W，工作3s，間隙6s），12000×g離心10min收集上清，即得到含有轉(zhuǎn)氨酶活性的粗酶液。

采用Ni-NTA親和層析對(duì)所得的粗酶液進(jìn)行分離純化。經(jīng)上樣、清洗和洗脫，收集洗脫液，透析除去小分子即得到純酶。適當(dāng)稀釋后，以考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定純酶的濃度。Ni-NTA親和層析過(guò)程中，細(xì)胞裂解緩沖液：50mmol/L磷酸二氫鈉/磷酸氫二鈉，300mmol/L氯化鈉，20mmol/L咪唑，pH8.0；洗脫緩沖液：50mmol/L磷酸二氫鈉/磷酸氫二鈉，300mmol/L氯化鈉，100mmol/L咪唑，pH8.0；再生緩沖液：50mmol/L磷酸二氫鈉/磷酸氫二鈉，300mmol/L氯化鈉，250mmol/L咪唑，pH8.0。

Ni-NTA親和層析后得到的ω-TA洗脫液經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)為電泳純化，如圖3所示，該酶液用20mMpH8.0磷酸緩沖液4℃透析24小時(shí)，除去咪唑等小分子雜質(zhì)，該重組酶于4℃冰箱保存。

以外消旋的三氟丙酮為底物，利用純化的ω-TA酶為催化劑，于20～40℃、pH6.5～8.5的緩沖體系中進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)。例如，在2mL的催化反應(yīng)體系中，添加0.5mgω-TA、10μmol三氟丙酮、30μmolL-丙氨酸或L-天冬氨酸以及0~2μmolPLP，在25℃反應(yīng)0.5～3h，所得的產(chǎn)物用5mL乙酸乙酯萃取，萃取液用于氣相色譜分析底物的轉(zhuǎn)化率。萃取液加入1mL三乙胺后靜置5min，然后再加入1.2mL乙酰氯反應(yīng)10min，所得的反應(yīng)液用手性毛細(xì)管氣相色譜法分析產(chǎn)物對(duì)映體過(guò)量值（ee）。

采用氣相色譜法分析底物的轉(zhuǎn)化率。所用氣相色譜儀為福立GC-9790氣相色譜儀，氣相色譜柱為30m×250μm×0.25μmKF-3，進(jìn)樣口和檢測(cè)器溫度分別為180℃和200℃，F(xiàn)ID檢測(cè)器，載氣（氮?dú)猓┝魉?0mL/min，氫氣流速為30mL/min，空氣流速為300mL/min。程序升溫條件為50℃維持5min，10℃/min升溫至180℃，維持5min。

用手性毛細(xì)管氣相色譜法分析產(chǎn)物對(duì)映體過(guò)量值（ee）。所用氣相色譜儀為滕州經(jīng)緯GC8100，手性毛細(xì)管氣相色譜柱為0.25mm×25mFS-LIPODEX-E，進(jìn)樣量為3μL，進(jìn)樣口和檢測(cè)器溫度分別為180℃和200℃，載氣（氮?dú)猓┝魉?0mL/min，氫氣流速為30mL/min，空氣流速為300mL/min。程序升溫條件為100℃維持2min，5℃/min升溫至150℃，維持5min。

將帶有重組質(zhì)粒pET-28a-ω-opt-TA的重組工程菌接種到20mL含有50μg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37℃、180rpm振蕩過(guò)夜培養(yǎng)，然后以1%的接種量接種到含有50μg/mL卡那霉素的100mLLB液體培養(yǎng)基，37℃、180rpm培養(yǎng)至OD600為0.6～0.8時(shí)，加入IPTG（終濃度為1mmol/L），25℃、150rpm繼續(xù)誘導(dǎo)18h。誘導(dǎo)結(jié)束后，4℃下4000×g離心10min，收集菌體沉淀。用pH8.0、0.1mol/L的磷酸緩沖液洗滌兩次，除盡培養(yǎng)基后再用原發(fā)酵液體積1/10的破胞緩沖液重懸細(xì)胞，在冰浴中超聲破胞90次（300W，工作3s，間隙6s），12000×g離心10min收集上清，即得到含有轉(zhuǎn)氨酶活性的粗酶液。

采用Ni-NTA親和層析對(duì)所得的粗酶液進(jìn)行分離純化。經(jīng)上樣、清洗和洗脫，收集洗脫液，透析除去小分子即得到純酶。適當(dāng)稀釋后，以考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定純酶的濃度。Ni-NTA親和層析過(guò)程中，細(xì)胞裂解緩沖液：50mmol/L磷酸二氫鈉/磷酸氫二鈉，300mmol/L氯化鈉，20mmol/L咪唑，pH8.0；洗脫緩沖液：50mmol/L磷酸二氫鈉/磷酸氫二鈉，300mmol/L氯化鈉，100mmol/L咪唑，pH8.0；再生緩沖液：50mmol/L磷酸二氫鈉/磷酸氫二鈉，300mmol/L氯化鈉，250mmol/L咪唑，pH8.0。

Ni-NTA親和層析后得到的ω-TA洗脫液經(jīng)SDS-PAGE檢測(cè)為電泳純化，如圖3所示，該酶液用20mMpH8.0磷酸緩沖液4℃透析24小時(shí)，除去咪唑等小分子雜質(zhì)，該重組酶于4℃冰箱保存。

以外消旋的三氟丙酮為底物，利用純化的ω-TA酶為催化劑，于20～40℃、pH6.5～8.5的緩沖體系中進(jìn)行轉(zhuǎn)化反應(yīng)。例如，在2mL的催化反應(yīng)體系中，添加0.5mgω-TA、10μmol三氟丙酮、30μmolL-丙氨酸或L-天冬氨酸以及0~2μmolPLP，在25℃反應(yīng)0.5～3h，所得的產(chǎn)物用5mL乙酸乙酯萃取，萃取液用于氣相色譜分析底物的轉(zhuǎn)化率。萃取液加入1mL三乙胺后靜置5min，然后再加入1.2mL乙酰氯反應(yīng)10min，所得的反應(yīng)液用手性毛細(xì)管氣相色譜法分析產(chǎn)物對(duì)映體過(guò)量值（ee）。

采用氣相色譜法分析底物的轉(zhuǎn)化率。所用氣相色譜儀為福立GC-9790氣相色譜儀，氣相色譜柱為30m×250μm×0.25μmKF-3，進(jìn)樣口和檢測(cè)器溫度分別為180℃和200℃，F(xiàn)ID檢測(cè)器，載氣（氮?dú)猓┝魉?0mL/min，氫氣流速為30mL/min，空氣流速為300mL/min。程序升溫條件為50℃維持5min，10℃/min升溫至180℃，維持5min。

用手性毛細(xì)管氣相色譜法分析產(chǎn)物對(duì)映體過(guò)量值（ee）。所用氣相色譜儀為滕州經(jīng)緯GC8100，手性毛細(xì)管氣相色譜柱為0.25mm×25mFS-LIPODEX-E，進(jìn)樣量為3μL，進(jìn)樣口和檢測(cè)器溫度分別為180℃和200℃，載氣（氮?dú)猓┝魉?0mL/min，氫氣流速為30mL/min，空氣流速為300mL/min。程序升溫條件為100℃維持2min，5℃/min升溫至150℃，維持5min。

在2mL的20mMpH8.0磷酸緩沖液中，添加0.25mgω-TA、5μmol三氟丙酮、15μmolL-天冬氨酸以及0.1μmolPLP，在25℃反應(yīng)1h，得到轉(zhuǎn)化率為97.0%的3,3,3-三氟丙胺。

主要參考資料

[1]梅蘇寧, 楊建明, 薛云娜, 王偉, 王為強(qiáng), & 呂劍. (2011). 含氟低級(jí)脂肪胺的合成及應(yīng)用進(jìn)展. 化工新型材料, 39(8), 19-22.

[2] 楊幼平, 陳小明, 王良芥, & 羅和安. (2004). 毛細(xì)管氣相色譜法測(cè)定水溶液中n,n-二甲基-2,3-二氯丙胺鹽酸鹽. 分析儀器(1), 37-39.

[3] 田良鑫. (1999). 全氟化碳心停搏液的心肌保護(hù)作用. 嶺南心血管病雜志(4), 295-296.