367-93-1 / IPTG的誘導(dǎo)原理

IPTG的誘導(dǎo)原理

【IPTG對(duì)外源蛋白誘導(dǎo)表達(dá)的原理】
原核生物絕大多數(shù)的基因按功能相關(guān)性成簇地排列，且密集于染色體上，共同形成一個(gè)轉(zhuǎn)錄單位——操縱子（元），也稱基因表達(dá)的協(xié)同單位(a coordinated unit of gene expression)。E.coli的乳糖操縱子（元）含Z、Y及A三個(gè)結(jié)構(gòu)基因，分別編碼β-半乳糖苷酶（β-galactosidase）、通透酶（permease）和乙?；D(zhuǎn)移酶（transacetylase)；此外還有調(diào)控基因：操縱序列O（operator）、啟動(dòng)序列P（promoter）；而I(編碼Lac阻遏物，Lac repressor)不屬于乳糖操縱子。

圖1為IPTG誘導(dǎo)表達(dá)原理圖

Lac阻遏物是一種具有4個(gè)相同亞基的四級(jí)結(jié)構(gòu)蛋白，都有一個(gè)與誘導(dǎo)劑結(jié)合的位點(diǎn)。在沒有乳糖存在時(shí)，lac操縱子（元）處于阻遏狀態(tài)，Lac阻遏物能與操縱基因O結(jié)合，阻礙RNA聚合酶與P序列結(jié)合，抑制轉(zhuǎn)錄起動(dòng)。而當(dāng)有誘導(dǎo)劑與阻遏蛋白結(jié)合后，其蛋白構(gòu)象就發(fā)生變化，導(dǎo)致阻遏物從操縱基因O上解離下來，RNA聚合酶不再受阻礙，發(fā)生轉(zhuǎn)錄。
在這個(gè)操縱子（元）體系中，真正的誘導(dǎo)劑并非乳糖本身。乳糖進(jìn)入細(xì)胞，經(jīng)β-半乳糖苷酶催化，轉(zhuǎn)變?yōu)榘肴樘?mdash;—即生理上的誘導(dǎo)劑。而在實(shí)驗(yàn)中，通常選用異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）作為誘導(dǎo)劑，IPTG是一種作用極強(qiáng)的誘導(dǎo)劑，不被細(xì)菌代謝而十分穩(wěn)定，因此被實(shí)驗(yàn)室廣泛應(yīng)用。

【IPTG對(duì)外源蛋白誘導(dǎo)表達(dá)的實(shí)驗(yàn)步驟】
1.實(shí)驗(yàn)方法
材料：
（1）誘導(dǎo)表達(dá)材料：LB（Luria—Bertani）培養(yǎng)基：酵母膏(Yeast extract)5g、蛋白胨(Peptone) 10g、NaCl 10g、瓊脂(Agar) 1-2%、蒸餾水(Distilled water) 1000ml pH 7.0、
IPTG 貯備液：2g IPTG溶于10mL蒸餾水中，0.22μm濾膜過濾除菌，分裝成1mL/份，-20 ℃保存；
凝膠電泳加樣緩沖液：50mmol/L Tris-CI( pH 6.8)、50mmol/LDTT、2% SDS（電泳級(jí)）、0.1％ 溴酚藍(lán)、10％ 甘油
（2）大腸桿菌包涵體的分離與蛋白純化材料：
1)酶溶法
裂解緩沖液：50 mmol/L Tris-CI(pH 8.0)、1 mmol/L EDTA、100 mmol/L NaCI；50 mmol/L 苯甲基磺酰氟(PMSF)；10 mg/mL溶菌酶；脫氧膽酸；1 mg/mL DNaseI.
2)超聲破碎法
TE 緩沖液.
2×SDS-PAGE 凝膠電泳加樣緩沖液：100 mmol/L Tris-HCI (pH 8.0)、100 mmol/L DTT、4 %SDS、0.2 % 溴酚藍(lán)、20 % 甘油。
2.實(shí)驗(yàn)方案
（1）外源基因的誘導(dǎo)表達(dá)：
1) 用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切核酸酶消化載體DNA和目的基因；
2) 按連接步驟連接目的基因和載體，并轉(zhuǎn)化到轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞中；
3) 分別挑取單菌落接種于5mL LB ( 0.1g·L-1 氨芐青霉素)中，37℃培養(yǎng)過夜；
4) 以2%體積比轉(zhuǎn)接于2ml LB( 0.1 g·L-1 氨芐青霉素)中，37℃繼續(xù)培養(yǎng)2.5 hr，至細(xì)菌對(duì)數(shù)生長期，加0.1mmol/L IPTG 2μl誘導(dǎo)3-4hr，同時(shí)設(shè)立不加IPTG誘導(dǎo)作為對(duì)照；
5) 取上述菌液1mL，12000rpm離心10min，收菌沉淀；
6) 重懸于冰的100μl PBS中，加入PMSF至終濃度為10 mmol/L。震蕩器震蕩混勻，加入2×加樣緩沖液，煮沸10min變性，12,000rpm離心10min；
7) 分別取誘導(dǎo)前和誘導(dǎo)后的樣品10 μl進(jìn)行SDS-PAGE電泳分析。
（2）大腸桿菌包涵體的分離與蛋白質(zhì)純化：
細(xì)菌的裂解
常用方法有：① 高溫珠磨法;② 高壓勻漿;③ 超聲破碎法;④ 酶溶法;⑤ 化學(xué)滲透等.前三種方法屬機(jī)械破碎法,并且方法① 、② 已在工業(yè)生產(chǎn)中得到應(yīng)用,后三種方法在實(shí)驗(yàn)室研究中應(yīng)用較為廣泛.下面介紹酶溶法和超聲破碎法的實(shí)驗(yàn)步驟.
酶溶法.常用的溶解酶有溶菌酶;β-1,3 -葡聚糖酶;β-1,6 -葡聚糖酶;蛋白酶;殼多糖酶;糖昔酶等.溶菌酶主要對(duì)細(xì)菌類有作用,而其他幾種酶對(duì)酵母作用顯著.主要步驟為：
4 ℃ ,5000rpm 離心,15 min ,收集誘導(dǎo)表達(dá)的細(xì)菌培養(yǎng)液(100 mL ).棄上清,約每克濕菌加3 mL 裂解緩沖液,懸浮沉淀.

【IPTG誘導(dǎo)大腸桿菌表達(dá)目標(biāo)蛋白的作用原理】
用乳糖操縱子作為啟動(dòng)子進(jìn)行蛋白質(zhì)表達(dá)的時(shí)候,需要誘導(dǎo)物進(jìn)行誘導(dǎo)(相當(dāng)于點(diǎn)火),但乳糖可以被細(xì)胞利用掉,所以利用IPTG(異丙基-β-D-硫代半乳糖苷)在結(jié)構(gòu)上與乳糖的相似性也可以將基因表達(dá)啟動(dòng),但它不能被細(xì)胞利用掉,從而實(shí)現(xiàn)持續(xù)的表達(dá).

【主要參考資料】
[1]https://www.biodiscover.com/news/research/121770.html.
[2]https://www.doc88.com/p-0468747498683.html.
[3]https://www.bio1000.com/experiment/protein/378113.html.
[4]https://wenda.so.com/q/1378486341071301.