9001-64-3 / 蘋果酸脫氫酶的應(yīng)用

背景及概述^[1][2]

蘋果酸脫氫酶(MDH)屬氧化還原酶類，EC1.1.1.37。催化蘋果酸氧化脫氫生成草酰乙酸的可逆反應(yīng)。人體組織中MDH有兩型同工酶，即存在于線粒體的m-MDH和存在于細(xì)胞質(zhì)的c-MDH。m-MDH在線粒體主要催化蘋果酸脫氫(氧化)，系三羧酸循環(huán)中的重要酶系之一，對(duì)體內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)的徹底氧化或相互轉(zhuǎn)變均起重要作用；c-MDH定位于胞液，主要催化草酰乙酸加氫(還原)，是蘋果酸穿梭系統(tǒng)保證胞液中糖酵解生成的NADH進(jìn)入線粒體徹底氧化產(chǎn)能的重要酶類。MDH在心肌、骨骼肌和腎含量最豐富。正常參考范圍：分光光度法：12.5～50.0mIU。血清MDH升高見于：心肌梗死初期，一般可超過正常參考值2～3倍以上，10～14d恢復(fù)正常；病毒性肝炎初期和病情極期，患者血清MDH總活性和m-MDH的升高幅度與病情的嚴(yán)重性相關(guān)；另外還見于惡性腫瘤肝轉(zhuǎn)移、創(chuàng)傷性休克、腎臟疾病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎及血液系統(tǒng)疾病等。新生兒血清MDH活性可達(dá)成人正常參考值上限的2倍；妊娠期血清升高。

結(jié)構(gòu)^[2]

1.序列比較

MDHs的氨基酸序列將其主要分為兩個(gè)亞類：一些細(xì)菌的MDHs與真核細(xì)胞線粒體MDHs(mitMDH)的氨基酸序列高度同源，歸為一個(gè)亞類，如EcMDH與豬mitMDH和酵母mitMDH一級(jí)結(jié)構(gòu)的一致性為58.3%及47.9%；其它細(xì)菌的MDHs，如嗜溫細(xì)菌MDH(ThermusflavusMDH，TfMDH)則與真核細(xì)胞葉MDHs(chlMDH)和細(xì)胞質(zhì)MDHs(cyMDH)的氨基酸序列更加相似，歸為另一個(gè)亞類。MDHs存在各種形式的同工酶，不同來源的MDHs氨基酸序列關(guān)系很復(fù)雜。氨基酸序列對(duì)比顯示動(dòng)植物細(xì)胞質(zhì)MDH和細(xì)菌MDH的氨基酸序列相似性為48% ～ 67%。而且同一細(xì)胞器的MDHs在物種間的相似性超過了不同細(xì)胞器來源的MDHs在物種內(nèi)的相似性，如大米的cyMDH與人、細(xì)菌的cyMDH的氨基酸序列同源性分別是59%和52%，但是大米的cyMDH和大米乙醛酸體MDH(gMDH)的氨基酸序列相似性只有24%，而豬mitMDH和豬cyMDH的序列相似性只有約20%。這表明在物種分化之前已經(jīng)形成了不同種類的MDH同工酶。

2.亞基組成及活性中心

MDHs為同源二聚體或四聚體，目前發(fā)現(xiàn)的真核生物MDHs都是二聚體，如豬心cyMDH和大米的cyMDH。大腸桿菌的MDH是二聚體，但芽孢桿菌類MDHs多為四聚體，如枯草桿菌和嗜熱脂肪芽孢桿菌的MDH。NAD-MDHs亞基分子在32 ～ 37 kDa之間，NADP-MDHs亞基分子量約42 kDa。不同來源的MDH的晶體結(jié)構(gòu)顯示，盡管其氨基酸序列的同源性不高，但是其空間結(jié)構(gòu)上卻有很多相似處，如重要的二級(jí)結(jié)構(gòu)元件、輔酶結(jié)合位點(diǎn)、起催化作用的關(guān)鍵氨基酸等。MDHs的每個(gè)亞基包含結(jié)構(gòu)性和功能性的兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，NAD結(jié)合結(jié)構(gòu)域占據(jù)著N-端，覆蓋了分子的一半，包含著一個(gè)平行的β-折疊結(jié)構(gòu)(Rossman折疊模體)。核心的二核苷酸結(jié)合結(jié)構(gòu)由4個(gè)β-折疊和一個(gè)α-螺旋組成。MDHs的C-端結(jié)構(gòu)域包含底物結(jié)合部位和催化必須的氨基酸殘基。酶的活性中心位于兩個(gè)結(jié)構(gòu)域之間的裂縫中。

小鼠cyMDH的結(jié)構(gòu)顯示，NAD-MDHs通常包含N-端的NAD結(jié)合區(qū)、催化區(qū)及C-端尾區(qū)三個(gè)結(jié)構(gòu)域，前兩者構(gòu)成MDH的活性中心。在NAD-MDHs的催化區(qū)中，Asp和His殘基是核心氨基酸，如Asp-150 和His-177是構(gòu)成EcMDH活性位點(diǎn)的重要氨基酸；Asp-152和His-180 是豬心cyMDH催化區(qū)中的關(guān)鍵氨基酸。它們通過氫鍵形成His-Asp離子對(duì)，在催化過程中作為質(zhì)子中轉(zhuǎn)系統(tǒng)，這也在一定程度上解釋了MDHs與NADH的結(jié)合比其與NAD的結(jié)合更穩(wěn)定些。而且His中的咪唑環(huán)、煙酰胺環(huán)以及Asp的羧基部分的相對(duì)位置對(duì)于MDHs的催化起著關(guān)鍵性作用。研究表明包括MDHs在內(nèi)的所有的2 -羥酸脫氫酶中都存在一個(gè)His-Asp離子對(duì)，它作為質(zhì)子中轉(zhuǎn)系統(tǒng)，催化時(shí)要求與2-羥基集團(tuán)正確定位，形成活性區(qū)域的陰離子空穴，以容納檸檬酸鹽、小的帶電陰離子如硫酸鹽。

3.輔酶特異性及底物特異性

NAD-MDHs和NADP-MDHs的催化部位及輔酶結(jié)合部位的同源性很高。Asp-53對(duì)于MDH的輔酶特異性至關(guān)重要，它在NAD-MDHs中高度保守，而在玉米等植物葉綠體NADP-MDH中，該位置的氨基酸都為Gly?；蛲蛔儗?shí)驗(yàn)表明，MDHs的輔酶特異性僅由幾個(gè)高度保守的氨基酸決定。Takeo等人構(gòu)建了嗜溫細(xì)菌TfMDH的兩種突變體酶EX3 和EX7。EX3 是將TfMDH中的第41、42、45 位氨基酸突變?yōu)槿~綠體NADP-MDH中的對(duì)應(yīng)氨基酸Gly、Ser和Ser。EX7是將41到47位氨基酸Glu-Ile-Pro-Gln-Ala-Met-Lys突變?yōu)槿~綠體NADP-MDH中對(duì)應(yīng)的Gly-Ser-Glu-Arg-Ser-Phe-Gln。結(jié)構(gòu)兩種突變體酶都實(shí)現(xiàn)了NAD+向NADP+輔酶特異性的轉(zhuǎn)變。同理將高粱葉綠體NADP-MDH的第84、85、87、88位氨基酸替換成TfMDH中對(duì)應(yīng)的Glu-Ile-Glu-Ala，突變體酶的動(dòng)力學(xué)參數(shù)也發(fā)生了不同程度的改變。來自嗜熱脂肪芽胞桿菌的LDH(BacillusstearothermophilusLDH，BsLDH)和EcMDH僅有25%的氨基酸序列一致性，但是兩種酶的蛋白質(zhì)折疊驚人的相似，只是在二級(jí)結(jié)構(gòu)上略有微小的差異。在兩者的活性中心，只有第102位的關(guān)鍵性殘基不同，在BsLDH中是Gln，而在EcMDH中是Arg。Wilks等人將BsLDH的Gln-102突變?yōu)锳rg-102，結(jié)果令人驚訝的將BsLDH轉(zhuǎn)變?yōu)楦咛禺愋缘腗DH。然而將EcMDH的Arg-102突變?yōu)镚ln-102后，突變體酶雖然可以特異的以丙酮酸為底物，但是催化效率很低。

理化特性^[2]

1. 最適pH值和最適溫度

MDHs的最適pH值偏堿性，約在8.0左右，如鏈霉菌(Streptomycesaureofaciens)和大腸桿菌的MDH(E.coliMDH，EcMDH)都在pH值8.1的時(shí)候酶活性最高。MDHs的最適反應(yīng)溫度為40 ～ 65℃。如枯草桿菌MDH和豬心肌MDH的最適溫度約50℃，嗜熱脂肪芽孢桿菌(BacillusstearothermophilusMDH，BsMDH)在65℃有較好的穩(wěn)定性。在溫度趨向兩極的情況下，大多數(shù)種屬的MDHs活力不高，但來自嗜寒細(xì)菌(Aquaspilliumarcticum)的MDH(AaMDH)在4℃左右仍然保持較高的活性，嗜熱細(xì)菌(Thermophilicbacterium)的MDH在90℃仍然可以保持1h左右的活力，這種差異可能是由于活性位點(diǎn)某種殘基的偏愛、底物和輔因子電荷的分布以及亞基間離子對(duì)的相互作用等原因造成的。

2.熱穩(wěn)定性

EcMDH和枯草桿菌MDH的熱穩(wěn)定性較差。嗜熱脂肪芽孢桿菌BsMDH在高溫下相當(dāng)穩(wěn)定。嗜寒細(xì)菌AaMDH不耐熱，推測與氫鍵數(shù)目、脯氨酸或甘氨酶分子的數(shù)量、位置、及它們的相互作用有關(guān)。有分析表明醇類物質(zhì)對(duì)MDHs的熱定有一定影響。在低溫環(huán)境下，甘油是維持MDHs活性的最好穩(wěn)定劑，而環(huán)多醇和山梨醇能在高溫下維持MDHs的活性。這種穩(wěn)定原理可能是羥基基團(tuán)和酶分子的相互作用或是醇類減少了介質(zhì)的介電常數(shù)而加強(qiáng)了酶分子的疏水作用，使酶蛋受水分子的影響減少。還有的研究表明，增加二硫鍵或氫鍵可以改善MDHs的熱穩(wěn)定性。如嗜熱細(xì)菌(Chlorobium tepidum)和嗜溫細(xì)菌(Chlorobium vibrioforme)的MDHs熱穩(wěn)定差異，是由于嗜熱細(xì)菌MDH的極性殘基在亞基之間形成更多的氫鍵。另外嗜熱細(xì)菌(Chloroflexusaurantiacus)的MDH含有更多的脯氨酸和丙氨酸殘基，能更好的穩(wěn)定蛋白質(zhì)骨架結(jié)構(gòu)，同時(shí)在二聚體之間，一些帶電荷的氨基酸所形成的離子間相互作用有助于蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性。

3.金屬離子的影響

帶各種電荷的離子對(duì)MDHs的活性及蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性影響不同，通過不同金屬離子對(duì)綠豆MDH的研究表明：K+有激活作用；Mg2 +和Ca2 +對(duì)酶活影響不大；Zn2 +、Pb2 +和Cu2 +對(duì)酶活有不同程度的抑制作用，其中Cu2 +抑制程度最強(qiáng)，當(dāng)其濃度為1M時(shí)，97%的酶活被抑制。還有來自嗜鹽古菌的MDH (HaloarculamarismortuiMDH，HmMDH)，其穩(wěn)定性受多種離子的影響，當(dāng)電荷密度高時(shí)，陰離子能有效的穩(wěn)定酶的折疊結(jié)構(gòu)，而陽離子需在低鹽濃度下時(shí)才能發(fā)揮相同的作用。

催化機(jī)制^[2]

MDHs催化蘋果酸羥基的氫離子定向地轉(zhuǎn)移到NAD(P)+上，實(shí)現(xiàn)蘋果酸與草酰乙酸之間的可逆轉(zhuǎn)換。MDHs活性部位由一個(gè)疏水的空泡組成，它包含了底物和輔酶的結(jié)合位點(diǎn)。當(dāng)形成酶-輔酶-底物三聚體復(fù)合物時(shí)，蛋白質(zhì)構(gòu)象發(fā)生改變。在這個(gè)變化過程中，復(fù)合體外部的一個(gè)環(huán)掩蓋住活性中心以保護(hù)底物和重要氨基酸不受溶劑的干擾，而其余的一些起催化作用的氨基酸向底物靠近，同時(shí)位于活性中心的His-Asp離子對(duì)在反應(yīng)過程中提供質(zhì)子。

研究表明MDHs活性區(qū)域高度保守的3個(gè)Arg決定其催化反應(yīng)的特異性。當(dāng)酶與底物接觸時(shí)，位于移動(dòng)環(huán)側(cè)鏈的2個(gè)Arg與底物相互作用，另一個(gè)Arg在底物轉(zhuǎn)化時(shí)與其羧基基團(tuán)的配位鍵結(jié)合，從而穩(wěn)定新形成的羥基和酮基產(chǎn)物。如豬心cyMDH與底物結(jié)合時(shí)，酶的Arg-91和Arg-97先固定在活性區(qū)的環(huán)中，His-186首先與底物C2的羰基氧原子結(jié)合，接著Arg-161的氫鍵直接結(jié)合到底物C1的羧基上，后Arg-97也結(jié)合到底物C2的羰基氧原子，從而完成了與底物結(jié)合的主要過程。在整個(gè)反應(yīng)中，第一步提供還原底物所需要的質(zhì)子，第二步協(xié)助底物定向和定位，最后一步是極化底物的羰基基團(tuán)而使C2上產(chǎn)生陽性電荷，從而激發(fā)NADH產(chǎn)生帶一對(duì)電子的質(zhì)子。同樣在EcMDH催化反應(yīng)時(shí)，Arg-81、Arg-87、Arg-153在穩(wěn)定和定位底物中發(fā)揮重要作用。首先Arg-81和Arg-87定位在一個(gè)環(huán)上，向活性區(qū)域彎曲并形成氫鍵與底物的4 -羧基和2 -羧基或酮相互作用，之后Arg-153由氫鍵結(jié)合在底物1-羧基上，從而完成與底物結(jié)合過程。

應(yīng)用^[2]

蘋果酸脫氫酶(malatedehydrogenase，MDH)存在于所有的生物體中，是生物糖代謝的關(guān)鍵酶之一，能催化蘋果酸與草酰乙酸之間的可逆轉(zhuǎn)換。MDH在細(xì)胞的多種生理活動(dòng)中起著重要的作用，包括線粒體的能量代謝以及植物的活性氧代謝等，具有較高的理論研究和經(jīng)濟(jì)利用意義。如MDH同工酶參與不同的細(xì)胞生理代謝途徑：cyMDH與丙酮酸羧化支路相聯(lián)，與非自養(yǎng)性的二氧化碳固定有關(guān)；mitMDH是TCA循環(huán)中的關(guān)鍵酶，提供能量；微體MDH與光呼吸或乙醛酸循環(huán)有關(guān)；葉綠體MDH主要在光合作用中固定二氧化碳。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中，酸性土壤中的鋁毒是農(nóng)作物生長的主要限制因子。研究發(fā)現(xiàn)，為了提高植物對(duì)土壤中磷元素的吸收，通過遺傳工程進(jìn)行植物分子改良育種，如在苜蓿中超量表達(dá)MDH基因后，增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因苜蓿對(duì)有機(jī)酸的吸收，從而提高適應(yīng)酸性土壤和對(duì)付鋁毒的耐受性。然而當(dāng)MDH高表達(dá)的時(shí)候，植物有機(jī)酸含量的增多可以增加細(xì)胞的滲透壓并且可以螯合除去部分離子，從而改善植物對(duì)鹽的耐受性。最近有人提出，利用嗜鹽細(xì)菌MDH的轉(zhuǎn)基因技術(shù)來提高農(nóng)作物的耐鹽性，如鹽生杜氏藻D.salina和D.bardwil是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最耐鹽真核生物，通過對(duì)它們的MDH基因克隆和序列的分析，可以為植物的耐鹽性研究奠定基礎(chǔ)。除此之外，在番茄F1 雜交種中，利用電泳檢測MDH同工酶酶譜之間的差異來鑒定的雜交種的純度，成為種子生產(chǎn)中一種新的省時(shí)省力的檢測方法，有利于鑒別高產(chǎn)，抗病，抗逆優(yōu)勢的雜交種，這為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來較大的經(jīng)濟(jì)效益。浙江大學(xué)劉艷荷等人通過對(duì)西方蜜蜂10個(gè)蜂種的MDHII等位基因頻率和蜂蜜、蜂王漿、蜂花粉、蜂蠟、蜂毒產(chǎn)量的研究，分析3個(gè)等位基因頻率與這5個(gè)經(jīng)濟(jì)性狀的相關(guān)性，認(rèn)為MDHII等位基因頻率將可能成為蜜蜂生產(chǎn)品質(zhì)的生化遺傳標(biāo)記。

MDH在醫(yī)學(xué)方面也引起越來越多的關(guān)注，如利用基因工程疫苗預(yù)防人體帶絳蟲病已是備受關(guān)注的研究方向，通過牛帶絳蟲亞洲亞種MDH基因的生物信息學(xué)分析，預(yù)測到胞漿型MDH是一個(gè)潛在的診斷抗原，這為帶絳蟲在診斷、藥物及疫苗研究中的應(yīng)用前景提供了重要的線索。后又實(shí)驗(yàn)證明其可在原核表達(dá)系統(tǒng)中獲得具有免疫學(xué)活性的高效表達(dá)，這為進(jìn)一步研究該蛋白的功能奠定了基礎(chǔ)。同時(shí)通過多種重組疫苗聯(lián)合免疫以求增大疫苗保護(hù)效果也成為今后研制絳蟲疫苗的主要方向。另外對(duì)華蟲睪吸蟲cyMDH活性位點(diǎn)的氨基酸突變研究，為進(jìn)一步了解及治療這種流行性疾病奠定了基礎(chǔ)。同樣對(duì)細(xì)粒棘球蚴中國大陸mitMDH的功能研究，有助于重組疫苗的研制，為預(yù)防該寄生蟲病提供了可能。

利用MDH底物專一性，還可將其用于拆分D，L-蘋果酸得到D-蘋果酸。D-蘋果酸是一種非天然有機(jī)酸，是一種極其重要的4 -碳有機(jī)手性源，主要應(yīng)用于手性藥物、手性添加劑、手性助劑等領(lǐng)域。近年來全世界對(duì)D-蘋果酸的需求量增加，從而引起了一些國家對(duì)D-蘋果酸的研究興趣。利用這種微生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)的蘋果酸，耗能低，清潔環(huán)保，是制藥行業(yè)合成泛酸、信息素及生物堿等手性物質(zhì)的手性源。

臨床意義^[3]

血清MDH活性升高常見于如下疾?。?/p>

1. 肝病在病毒性肝炎發(fā)病初期，患者血清總MDH活性和m-MDH的升高幅度與病情嚴(yán)重 程度呈正相關(guān)，但當(dāng)肝組織出現(xiàn)壞死時(shí)，血清c-MDH升高更為明顯，提示患者預(yù)后不良。原發(fā)性肝癌、肝轉(zhuǎn)移癌和其他中毒性肝損傷時(shí)，血清MDH總活性也會(huì)有不同程度的升高。

2. 急性心肌梗死：急性心肌梗死患者血清MDH活性升高明顯，可達(dá)正常參考值上限的3倍 以上，變化時(shí)程為： 24～48h達(dá)高峰，10～14d恢復(fù)正常。因此，MDH與CK、LDH、AST聯(lián)合檢 測有助于診斷心肌梗死。

3. 其他疾?。耗I臟疾病、類風(fēng)濕和風(fēng)濕性疾病、創(chuàng)傷性休克、血液系統(tǒng)疾病等，也可見血清 MDH活性不同程度的升高。

主要參考資料

[1] 臨床肝病實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)

[2] 診斷學(xué)大辭典

[3] 蘋果酸脫氫酶的結(jié)構(gòu)及功能