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間苯三酚（1,3,5-三羥基苯）是一種重要的精細(xì)化工產(chǎn)品，主要用于藥物合成的中間體，例如黃酮類化合物。作為治療心腦血管病的藥物，黃酮類化合物愈來愈受到藥物學(xué)家的重視。
a、溴化反應(yīng)：以間苯二酚為原料，首先將間苯二酚加入反應(yīng)容器中，然后加入氯仿進(jìn)行溶解，溶解后將N-溴代丁二酰亞胺溶于氯仿中得到的N-溴代丁二酰亞胺溶液滴加到反應(yīng)容器中，N-溴代丁二酰亞胺溶液滴加時(shí)間為30min，滴加完后升溫至60℃，在此溫度條件下反應(yīng)1h，反應(yīng)后得到反應(yīng)液，將所得反應(yīng)液常壓蒸出氯仿，蒸出氯仿后所得液體進(jìn)行減壓蒸餾，在真空度0.098MPa下收集150～160℃餾分，將所得餾分冷卻至常溫，得到4-溴間苯二酚；
所述間苯二酚與氯仿二者之間加入量的比例為每克間苯二酚加入氯仿2mL，所述N-溴代丁二酰亞胺與氯仿之間加入量的比例為每克N-溴代丁二酰亞胺加入氯仿0.9mL，所述間苯二酚與N-溴代丁二酰亞胺二者之間的質(zhì)量比為1:1.7；
b、水解反應(yīng)：將步驟a得到的4-溴間苯二酚加入反應(yīng)容器中，然后加入二甲苯、氫氧化鉀和催化劑銅，升溫至140℃條件下回流反應(yīng)6h；反應(yīng)后將反應(yīng)產(chǎn)物冷卻至60℃以下，并加入水?dāng)嚢杞禍刂潦覝?，過濾除去催化劑銅，過濾后得到的反應(yīng)液靜置分層，分層后取水相，得到間苯三酚鉀鹽溶液；
所述4-溴間苯二酚與二甲苯二者之間的加入量為每克4-溴間苯二酚加入二甲苯1.35mL，所述4-溴間苯二酚與氫氧化鉀之間加入的質(zhì)量比為1:1.06，所述4-溴間苯二酚與催化劑銅二者之間的質(zhì)量比為21:1；
c、酸化反應(yīng)：將步驟b得到的間苯三酚鉀鹽溶液加入反應(yīng)容器中，在攪拌條件下采用濃度為0.6mol/L的鹽酸調(diào)節(jié)其pH值為1～3，在此條件下析出固體，固體析出結(jié)束后進(jìn)行過濾，得到固體間苯三酚粗品；
d、粗品提純：將步驟c所得間苯三酚粗品加入反應(yīng)容器中，并加入水加熱至90～100℃進(jìn)行充分溶解，所述水的加入量為間苯三酚粗品質(zhì)量的4倍，溶解后加入活性炭回流脫色30min，活性炭的加入量占間苯三酚粗品質(zhì)量的3.6%，脫色后在90～100℃條件下進(jìn)行熱過濾，所得濾液自然冷卻析晶，析晶結(jié)束后過濾，所得產(chǎn)品采用純化水沖洗，沖洗后進(jìn)行干燥，干燥溫度為50℃，干燥時(shí)間為5h，干燥后得到間苯三酚。所得產(chǎn)品的純度為99.9%，其收率為73.2%。
生物催化合成間苯三酚的方法步驟是：
(一)抗間苯三酚突變株的篩選
將菌體稀釋到一定濃度，然后取菌液加入NaNO2溶液和HAC?NaAC緩沖液的混合液中，在37℃左右水浴振蕩培養(yǎng)。分別加入到Na2HPO4緩沖溶液混勻，并涂在含LiCl的平板上，37℃左右避光培養(yǎng)。
(二)phlD1基因克隆及重組菌株的獲得
提取細(xì)菌Pseudomonas fluorescens Pf?5基因組DNA，PCR擴(kuò)增獲得多聚酮合成酶基因(phlD)；再利用定點(diǎn)突變方法獲得變異基因phlD1，膠回收試劑盒回收目的片段，相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶酶切目的片段，37℃左右，3?4小時(shí)，乙醇沉淀純化目的片斷；用相同的限制性內(nèi)切酶酶切原核表達(dá)載體pET?30a(+)，膠回收試劑盒回收純化；載體與外源片段按摩爾比1∶3?10的比例，16℃左右連接過夜，即為構(gòu)建好的原核表達(dá)載體pET?phlD1；將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒42℃熱擊轉(zhuǎn)化到抗間苯三酚大腸桿菌中，經(jīng)酶切鑒定、PCR鑒定和測(cè)序篩選獲得陽性重組菌株；?80℃左右保存該菌株。
(三)工程大腸桿菌誘導(dǎo)表達(dá)
將工程菌接種到LB液體培養(yǎng)液中(內(nèi)含30?50μg·mL?1的卡那霉素)，37℃左右振蕩培養(yǎng)至OD600約為0.4?0.6時(shí)，在菌液中加入誘導(dǎo)劑IPTG，繼 續(xù)在37℃左右培養(yǎng)3?5小時(shí)，誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白；取出誘導(dǎo)后的培養(yǎng)液，取沉淀用磷酸緩沖液洗滌，按1:10的比例(w/v)再用此緩沖液重懸細(xì)胞，加入2×SDS?PAGE上樣緩沖液，煮沸，SDS?PAGE電泳檢測(cè)，即可檢測(cè)到表達(dá)的相應(yīng)融合蛋白條帶。
(四)間苯三酚的發(fā)酵
配制發(fā)酵培養(yǎng)基，滅菌，冷卻時(shí)進(jìn)行無菌接種。按照正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果，培養(yǎng)基初始，并通過溫度電極和pH電極感應(yīng)，自動(dòng)調(diào)節(jié)發(fā)酵液的溫度和pH，攪拌發(fā)酵培養(yǎng)。
(五)間苯三酚的提取
發(fā)酵上清液中的間苯三酚，經(jīng)乙酸乙酯萃取，回收乙酸乙酯并減壓濃縮，制得間苯三酚。
[1] [中國(guó)發(fā)明,中國(guó)發(fā)明授權(quán)] CN201310622931.0 間苯三酚的制備方法
[2] [中國(guó)發(fā)明,中國(guó)發(fā)明授權(quán)] CN200810225401.1 微生物催化合成間苯三酚