ELISA是一種酶聯(lián)免疫分析測定技術(shù)，提供一種檢測或量化特定分析物濃度的工具。在實(shí)驗(yàn)中，ELISA的測定標(biāo)準(zhǔn)格式分為96微孔板（通常為8行12列）。每個微孔都經(jīng)過預(yù)處理以產(chǎn)生反應(yīng)，在大多數(shù)情況下，反應(yīng)會導(dǎo)致微孔中溶液的顏色發(fā)生變化。分光光度計用于檢測穿過該溶液的光量?？讖耐该鳎o反應(yīng)）變?yōu)樯钏{(lán)色（100%反應(yīng)），顏色變深時，可通過分光光度計記錄的光密度讀數(shù)變化檢測出來。將未知分析物的濃度與標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行比較，該標(biāo)準(zhǔn)曲線是使用已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)制劑構(gòu)建的。

  ELISA數(shù)據(jù)輸出類型

  ELISA數(shù)據(jù)輸出類型分為3類，這3類分別如下：

  1.定性ELISA：該檢測提供簡單的陽性或陰性結(jié)果，它只能通過與沒有抗原或無關(guān)對照抗原的空白孔進(jìn)行比較來確認(rèn)是否存在任何抗原。

  2.半定量ELISA：該檢測方法比較被測樣本中抗原的相對含量。檢測到的信號強(qiáng)度將直接對應(yīng)于抗原的含量。但是，由于ELISA試劑盒中不存在標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)，因此無法通過此方法計算出準(zhǔn)確的濃度。

  3.定量ELISA：該檢測方法可計算樣本中抗原的準(zhǔn)確含量。使用已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)蛋白通過一系列連續(xù)稀釋構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線?？梢詮臉?biāo)準(zhǔn)曲線中插入未知的抗原濃度，以計算樣本中抗原的含量。此程序最常用于報告ELISA數(shù)據(jù)。

  ELISA檢測標(biāo)準(zhǔn)曲線

  使用標(biāo)準(zhǔn)或校準(zhǔn)曲線定量計算待測樣本中未知抗原的濃度。標(biāo)準(zhǔn)曲線是使用標(biāo)準(zhǔn)參考抗原的已知濃度與每個濃度的光密度（通常使用平板讀數(shù)器在450nm處）繪制的。

  大多數(shù)酶標(biāo)儀通常都配有軟件，可自動進(jìn)行數(shù)據(jù)分析和曲線擬合。通過外推標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性部分來計算未知抗原。紀(jì)寧在這里建議在進(jìn)行ELISA測定時，對樣品進(jìn)行兩次或三次重復(fù)，以確保結(jié)果的良好統(tǒng)計驗(yàn)證?？梢杂嬎銟?biāo)準(zhǔn)偏差(SD)和變異系數(shù)(CV)來評估移液的精度，最佳實(shí)踐的CV值應(yīng)保持在20%以下。

  此外，建議在ELISA板設(shè)置過程中加入陽性對照（已知分析物數(shù)量或存在分析物的樣品）和陰性對照（沒有分析物數(shù)量或存在的樣品）。

  曲線擬合軟件

  1.半對數(shù)圖：使用濃度對微孔板讀數(shù)的對數(shù)。生成典型的S形曲線，使數(shù)據(jù)點(diǎn)分布更均勻。該方法有助于抵消線性圖導(dǎo)致的下端壓縮。

  2.線性圖：繪制一條曲線，一條軸表示抗原濃度，另一條軸表示微孔板讀數(shù)。大多數(shù)情況下，R2值大于0.99表示曲線擬合良好。值得注意是，線性圖會壓縮數(shù)據(jù)點(diǎn)，尤其是在曲線的下端，這會導(dǎo)致分辨率降低。

  3.對數(shù)/對數(shù)圖：這在低至中等濃度范圍內(nèi)很常見，因?yàn)樗诖朔秶鷥?nèi)具有良好的線性。但是，如果濃度增加到更高的范圍，則會發(fā)現(xiàn)線性會消失。

  4.4PL或5PL曲線（4或5參數(shù)物流）：這些是高度復(fù)雜的程序，需要更復(fù)雜的計算。4PL方法基于感染點(diǎn)周圍的對稱性，而5PL方法考慮不對稱性，對于大多數(shù)免疫測定來說，5PL通常更適合。

  峰值恢復(fù)

  加標(biāo)回收有助于確定樣品中是否存在可能干擾抗體與抗原結(jié)合過程的成分。該過程通過使用已知濃度的重組蛋白加標(biāo)樣品基質(zhì)來執(zhí)行。進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)ELISA測定，并從標(biāo)準(zhǔn)曲線推斷蛋白質(zhì)濃度。蛋白質(zhì)的回收率以百分比表示，通常，低于80%的值表示基質(zhì)中存在干擾測定的成分。在這種情況下，我們建議使用不同的ELISA試劑盒。

  變異系數(shù)（CV）

  變異系數(shù)對于確定所獲得的數(shù)據(jù)或結(jié)果中的任何不準(zhǔn)確性或不一致性非常重要。這通常表示為相對于平均值的方差百分比。方差越大，預(yù)期的不一致或不準(zhǔn)確性就越大。導(dǎo)致變異系數(shù)(CV)過高的一些常見因素包括樣品污染、溫度變化、移液錯誤、清洗不充分和孔變干。

  上述是紀(jì)寧為大家簡要介紹下ELISA試劑盒數(shù)據(jù)分析的概念。數(shù)據(jù)分析是非常重要的工作，它可以檢驗(yàn)ELISA實(shí)驗(yàn)的成果，了解這些概念可以更有效幫助您做數(shù)據(jù)分析。