酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）有助于量化給定樣本中存在的目標量。在進行ELISA實驗，樣本制備是非常重要的，這也覺得實驗成功的關(guān)鍵。

  樣本制備完成后，可以分裝并冷凍以便長期保存。建議的儲存條件如下：2-8°C保存5天，-20°C保存6個月，-80°C保存2年。還建議在從存儲中取出樣本時避免反復(fù)凍融循環(huán)，因此最好將樣本分裝到較小的份量中保存。

  有許多不同的樣本可用于ELISA方法。下面將討論一些最常見的樣本，并提供有關(guān)如何最好地制備每種樣本的一般說明。但是，我們建議遵循每個試劑盒提供的具體說明，因為不同試劑盒的方案可能會略有不同。

  不同的樣本類型

  血清樣本

  血清：不含任何血細胞或凝血因子；它就像沒有纖維蛋白原的血漿。

  （a）使用含有促凝劑的血清分離管采集全血樣本。將血液樣本在室溫下靜置30-60分鐘以使其凝固，然后在4°C下放置1-2小時（或2-8°C過夜）以促進完全凝固。

  （b）之后，將樣品以1000xg（例如，使用半徑為10cm的離心機，轉(zhuǎn)速約為2500rpm）離心20分鐘。

  （c）小心地將上清液（血清）轉(zhuǎn)移到干凈的試管中，避免吸取到下層血細胞和凝塊。血清可以立即用于分析，或在-20°C或-80°C下冷凍保存以備后用。

  血漿樣本

  血漿需要使用抗凝劑，具體選擇取決于目標分析物。常用的抗凝劑包括EDTA（常用于血液學檢測）、檸檬酸鈉（常用于凝血功能檢測）和肝素（常用于生化檢測）。

  (a)將血液收集到含有相應(yīng)抗凝劑的試管中，立即輕輕顛倒試管5-10次，確保血液與抗凝劑充分混合。

  (b)建議在收集樣品后盡快離心，最好在30分鐘內(nèi)，具體時間取決于目標分析物。在2-8°C下以1000xg（例如，使用半徑為10cm的離心機，轉(zhuǎn)速約為2500rpm）離心樣品15分鐘。

  (c)小心地將上清液（血漿）轉(zhuǎn)移到干凈的試管中，避免吸取到下層血細胞。

  (d)血漿可以立即用于分析，也可以在-20°C或-80°C下冷凍保存以備后用。避免反復(fù)凍融。

  組織樣本

  幾乎所有的組織樣本都需要進行勻漿處理，具體方案取決于所提取的組織和目標分析物。為了防止蛋白水解和其他降解過程，通常需要添加適當?shù)牡鞍酌敢种苿┖推渌种苿?/span>

  (a)使用無菌的不銹鋼解剖工具解剖組織，并迅速置于冰上以抑制酶活性。

  (b)使用預(yù)冷的0.01MPBS緩沖液（pH7.4）輕輕洗滌組織三次，以盡可能去除殘留血液。

  (c)稱重組織，然后將其切碎或剪碎。將組織加入適量的勻漿緩沖液（根據(jù)目標分析物和組織類型選擇）中，使用合適的勻漿器（例如，組織研磨器、超聲波破碎儀等）進行勻漿。建議記錄組織與勻漿緩沖液的比例。

  (d)將處理后的勻漿以5000xg（例如，使用半徑為10cm的離心機，轉(zhuǎn)速約為6000rpm）離心5分鐘。

  (e)小心地將上清液轉(zhuǎn)移到干凈的試管中。

  (f)上清液可以立即用于分析，也可以在-20°C或-80°C下冷凍保存以備后用。避免反復(fù)凍融。

  一些組織樣本，例如腎臟、肝臟、胰腺和腦組織，含有內(nèi)源性生物素，可能與親和素和鏈霉親和素相互作用，導(dǎo)致假陽性結(jié)果。在分析這些組織樣本時，需要考慮生物素干擾的可能性，并采取相應(yīng)的措施。

  細胞樣本

  為了進行ELISA分析，首先需要裂解細胞以釋放目標蛋白。裂解方法可以是化學方法（例如使用TritonX-100、脫氧膽酸鈉、RIPA、SDS、DTT和尿素等試劑）或物理方法（例如反復(fù)凍融循環(huán)或超聲處理）。選擇哪種方法取決于目標蛋白和下游應(yīng)用，需要根據(jù)具體情況進行優(yōu)化。

  (a)對于貼壁細胞，使用胰蛋白酶消化細胞，然后離心收集細胞沉淀，棄去上清液。對于懸浮細胞，直接離心收集細胞沉淀，棄去上清培養(yǎng)基。離心力及時間需根據(jù)細胞類型進行優(yōu)化。

  (b)將細胞沉淀重懸于預(yù)冷的PBS中，離心洗滌三次，以去除殘留的培養(yǎng)基和雜質(zhì)。

  (c)使用合適的裂解方法裂解細胞。例如，加入預(yù)冷的RIPA裂解液（具體配方...），冰上孵育一段時間（例如30分鐘），并進行渦旋振蕩?；蛘?，進行四次凍融循環(huán)（將樣品置于液氮中快速冷凍，然后在37°C水浴中快速解凍）?；蛘撸褂贸暡ㄆ扑閮x進行超聲處理（具體參數(shù)...）。

  (d)以1500xg（例如，使用半徑為10cm的離心機，轉(zhuǎn)速約為3500rpm）離心10分鐘，以去除細胞碎片。

  (e)小心地將上清液（細胞裂解物）轉(zhuǎn)移到干凈的試管中。

  (f)細胞裂解物可以立即用于分析，也可以在-20°C或-80°C下冷凍保存以備后用。避免反復(fù)凍融。

  細胞培養(yǎng)上清液

  當目標分析物是分泌蛋白時，可以使用細胞培養(yǎng)上清液進行ELISA檢測。

  (a)以1000xg（例如，使用半徑為10cm的離心機，轉(zhuǎn)速約為2500rpm）離心20分鐘，以去除細胞碎片和沉淀物。

  (b)小心地將上清液轉(zhuǎn)移到干凈的試管中。

  (c)細胞培養(yǎng)上清液可以立即用于分析，也可以在-20°C或-80°C下冷凍保存以備后用。避免反復(fù)凍融。

  痰液樣本

  痰液是由呼吸道分泌的粘液，其中可能包含唾液、細胞碎片、細菌、炎癥細胞等。痰液樣本常用于檢測呼吸道感染的病原體。

  (a)收集新鮮的痰液樣本到無菌容器中。記錄痰液樣本的體積。

  (b)向痰液樣本中加入等體積的0.1%DTT溶液（DTT用于溶解痰液），并在37°C水浴中孵育5分鐘，并定期輕輕混勻。

  (c)使用1xPBS將DTT-痰液混合物稀釋至1/2的濃度，并在室溫下繼續(xù)輕輕混勻15-20分鐘。

  (d)使用孔徑為XXμm的金屬絲網(wǎng)過濾混合物，以去除較大的雜質(zhì)和粘液塊。

  (e)以1500xg（例如，使用半徑為10cm的離心機，轉(zhuǎn)速約為3500rpm）離心10分鐘，使細胞碎片和細菌沉淀。

  (f)小心地將上清液轉(zhuǎn)移到干凈的試管中。

  (g)上清液可以立即用于分析，也可以在-20°C或-80°C下冷凍保存以備后用。避免反復(fù)凍融。

  腦脊液、腹水和支氣管肺泡灌洗液(BALF)樣本

  腦脊液、腹水和支氣管肺泡灌洗液(BALF)等體液樣本的處理方法略有不同，需要根據(jù)具體情況進行調(diào)整。以下是一些通用的指導(dǎo)原則：

  （a）腦脊液：

  收集新鮮的腦脊液樣本到無菌容器中。

  以400xg(例如，使用半徑為10cm的離心機，轉(zhuǎn)速約為1800rpm)離心10分鐘，以去除細胞。

  小心地將上清液轉(zhuǎn)移到干凈的試管中，避免擾動沉淀。

  上清液可以立即用于分析，也可以在-20°C或-80°C下冷凍保存以備后用。避免反復(fù)凍融。細胞沉淀可以根據(jù)需要進行進一步分析。

  （b）腹水：

  收集新鮮的腹水樣本到無菌容器中。

  以1000xg(例如，使用半徑為10cm的離心機，轉(zhuǎn)速約為2500rpm)離心10分鐘，以去除細胞和雜質(zhì)。

  小心地將上清液轉(zhuǎn)移到干凈的試管中，避免擾動沉淀。

  上清液可以立即用于分析，也可以在-20°C或-80°C下冷凍保存以備后用。避免反復(fù)凍融。細胞沉淀可以根據(jù)需要進行進一步分析。

  （c）支氣管肺泡灌洗液(BALF)：

  收集新鮮的BALF樣本到無菌容器中。

  可選步驟：使用無菌紗布或細胞濾網(wǎng)過濾BALF，以去除粘液和大的組織碎片。

  以450xg(例如，使用半徑為10cm的離心機，轉(zhuǎn)速約為2000rpm)離心10分鐘，以去除細胞和雜質(zhì)。

  小心地將上清液轉(zhuǎn)移到干凈的試管中，避免擾動沉淀。

  上清液可以立即用于分析，也可以在-20°C或-80°C下冷凍保存以備后用。避免反復(fù)凍融。細胞沉淀可以根據(jù)需要進行細胞計數(shù)、分類和進一步分析。

  友情提示：以上只是一些通用的指導(dǎo)原則，具體的操作步驟和參數(shù)需要根據(jù)實驗?zāi)康暮蜆颖绢愋瓦M行優(yōu)化。建議查閱相關(guān)文獻或咨詢專業(yè)人士，以確定最佳的處理方法。始終保持無菌操作，以防止樣本污染。

  上述是紀寧為大家介紹在進行ELISA實驗時候，常見的樣本制備的方法，樣本制備好壞對ELISA實驗影響非常大，正確的進行樣本制備可以提高實驗效果。