在所有分子生物學(xué)領(lǐng)域中，用于核酸（DNA、RNA）定量的首選方法是實(shí)時(shí)熒光定量PCR（QuantitativeReal-timePCR，qPCR）。它能實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增DNA的事實(shí)。與傳統(tǒng)PCR相比，它是一種定量方法，它能夠確定樣本中擴(kuò)增DNA的精確量（相對(duì)或絕對(duì)）。相反，在傳統(tǒng)PCR中，擴(kuò)增的DNA只能在擴(kuò)增完成后才能檢測(cè)到（終點(diǎn)檢測(cè)）。

  除了DNA，RNA也可用作模板（例如，在基因表達(dá)研究或RNA病毒檢測(cè)中）。在這種情況下，需要將RNA逆轉(zhuǎn)錄為DNA（也稱為互補(bǔ)DNA或cDNA），然后使用實(shí)時(shí)PCR進(jìn)行擴(kuò)增。這種組合方法有一個(gè)術(shù)語(yǔ)：實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄PCR或簡(jiǎn)稱為qRT-PCR（有時(shí)稱為RT-qPCR）。

  工作原理

  PCR是一種利用酶（熱穩(wěn)定DNA聚合酶，最初于20世紀(jì)60年代從美國(guó)黃石公園熱湖中生長(zhǎng)的水生棲熱菌中分離出來(lái)的）循環(huán)擴(kuò)增模板DNA的短片段（擴(kuò)增子）的方法。在每個(gè)循環(huán)中，DNA的短片段數(shù)量都會(huì)翻倍，從而導(dǎo)致目標(biāo)呈指數(shù)級(jí)擴(kuò)增。

  在qPCR中，發(fā)生的程序完全相同，但有兩個(gè)主要區(qū)別：首先，擴(kuò)增的DNA是熒光標(biāo)記的（通常使用基于花菁的熒光染料），其次，擴(kuò)增過(guò)程中釋放的熒光量與擴(kuò)增的DNA量成正比。整個(gè)PCR過(guò)程（以及所有30至45個(gè)循環(huán)）都會(huì)監(jiān)測(cè)熒光。樣本中DNA分子的初始數(shù)量越多，PCR循環(huán)中熒光增加的速度就越快（圖1和2）。也就是說(shuō)如果樣本包含較多靶標(biāo)，則可以在較早的循環(huán)中檢測(cè)到熒光?？梢詸z測(cè)到熒光的循環(huán)稱為定量循環(huán)（簡(jiǎn)稱Cq），是qPCR的基本結(jié)果：Cq值越低，意味著靶標(biāo)的初始拷貝數(shù)越高。這是實(shí)時(shí)PCR提供的定量方法的基本原理。

圖 1：以圖形方式描述了 PCR 管中發(fā)生的 qPCR 擴(kuò)增（前兩個(gè)循環(huán)）。qPCR 信號(hào)分子（也稱為化學(xué)物質(zhì)）有不同的變體，它們的熒光標(biāo)記方式略有不同。圖中顯示了兩種最常見(jiàn)的原理。左側(cè)顯示的是使用 FRET 機(jī)制（熒光共振能量轉(zhuǎn)移）的 5′-核酸外切酶變體，其中報(bào)告熒光團(tuán) (R) 的熒光被轉(zhuǎn)移到猝滅劑 (Q)，并且當(dāng)報(bào)告分子和猝滅劑分子接近時(shí)不會(huì)發(fā)射熒光（例如 TaqMan）。當(dāng)兩者錯(cuò)位時(shí)（當(dāng)探針在 PCR 延伸過(guò)程中被 TaqDNA 聚合酶的 5′-核酸外切酶活性移除時(shí)），報(bào)告分子會(huì)自由發(fā)射熒光，然后可以檢測(cè)到。右側(cè)顯示的是使用插入熒光團(tuán)的 qPCR 變體（例如 SYBR Green）。使用特殊的插入染料，當(dāng)它們插入 dsDNA 中時(shí)，熒光發(fā)射會(huì)大大增加。

圖 2：顯示包含五個(gè)樣本（S1 至 S5）的擴(kuò)增圖。每個(gè)樣本中的 DNA 在每個(gè)循環(huán)中都被擴(kuò)增，熒光隨之增加。在上面的例子中，樣本 S1 包含的初始目標(biāo) DNA 數(shù)量最多，因此熒光增加最快。樣本 S4 包含的初始目標(biāo) DNA 分子數(shù)量最少，而 S5 則不包含任何目標(biāo) DNA 分子。

  有幾種方法可以獲得Cq值（Cq調(diào)用）、我們應(yīng)該定期檢查的擴(kuò)增曲線參數(shù)、將Cq值轉(zhuǎn)換為基因表達(dá)的絕對(duì)或相對(duì)拷貝數(shù)的方法等。一旦掌握了這些技能，qPCR就會(huì)成為您研究中真正強(qiáng)大的技術(shù)。

  擴(kuò)增的DNA有多種熒光標(biāo)記方法（也稱為“qPCR化學(xué)方法”），但我們?cè)诖瞬蛔髟敿?xì)討論。它們都有一個(gè)共同點(diǎn)：在PCR反應(yīng)過(guò)程中產(chǎn)生熒光信號(hào)，該信號(hào)是可量化的，并且與DNA的起始量成正比。

  qPCR的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)

  優(yōu)于傳統(tǒng)PCR：

  1.速度：擴(kuò)增的DNA在PCR反應(yīng)的同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，因此無(wú)需像傳統(tǒng)PCR那樣在反應(yīng)后進(jìn)行單獨(dú)檢測(cè)（例如在瓊脂糖凝膠上）。

  2.通量：qPCR被認(rèn)為是一種高通量方法（在短時(shí)間內(nèi)處理大量樣品），因?yàn)樗c用于樣品制備的液體處理自動(dòng)化站兼容（DNA/RNA分離和加載到qPCR板上）。

  3.靈敏度：qPCR可以區(qū)分2倍大小的目標(biāo)DNA分子，甚至可以檢測(cè)到少量的起始DNA分子，與PCR相比，使用量?jī)H為1/1000。

  4.定量范圍：可進(jìn)行幾個(gè)數(shù)量級(jí)的廣泛定量（動(dòng)態(tài)范圍高達(dá)107倍）。

  5.可重復(fù)性：一般認(rèn)為具有高度可重復(fù)性。

  qPCR的缺點(diǎn)：

  1.設(shè)備成本：由于敏感熒光檢測(cè)所需的光學(xué)元件，qPCR循環(huán)儀比傳統(tǒng)PCR熱循環(huán)儀貴五到十倍。

  2.化學(xué)品和耗材成本：qPCR是一種非常靈敏的方法，因此，反應(yīng)混合物的精確成分和高質(zhì)量極其重要。這就是為什么通常購(gòu)買(mǎi)即用型反應(yīng)混合物（主混合物）的原因。由于檢測(cè)方法（熒光）靈敏，因此需要一套特定的塑料器皿。

  3.上樣時(shí)間：與傳統(tǒng)PCR相比，將qPCR樣品上樣到板中通常是一個(gè)更加精確和繁瑣的過(guò)程，這主要是因?yàn)槭褂玫脑噭┖蜆悠窋?shù)量更多，而且該方法的靈敏度極高。但是，如果使用PlatR等移液輔助器，上樣時(shí)間可以大大縮短。

  4.PCR反應(yīng)抑制：由于生物樣本的復(fù)雜性，核酸分離過(guò)程中不完善的純化過(guò)程可能會(huì)在分離的樣本中留下各種物質(zhì)的痕跡。PCR反應(yīng)有時(shí)會(huì)被這些物質(zhì)抑制，也稱為PCR反應(yīng)抑制劑（DNA聚合酶易受某些抑制其活性的化合物的影響）。這會(huì)使定量過(guò)程復(fù)雜化。

  5.誤差敏感性：qPCR是一種極其敏感的方法，因此很容易出錯(cuò)。這意味著即使是最輕微的錯(cuò)誤也會(huì)對(duì)最終結(jié)果產(chǎn)生重大影響。最易變和最關(guān)鍵的一點(diǎn)是樣品的制備（DNA提取和逆轉(zhuǎn)錄）。這就是為什么在進(jìn)行測(cè)定時(shí)需要包括幾個(gè)控制反應(yīng)（例如無(wú)模板控制、緩沖液控制）以確保每次運(yùn)行的質(zhì)量控制檢查。

  6.數(shù)據(jù)分析：數(shù)據(jù)分析和結(jié)果解釋比傳統(tǒng)PCR更復(fù)雜，但結(jié)果更具信息量。

  由于其強(qiáng)大的優(yōu)勢(shì)，qPCR的應(yīng)用范圍非常廣泛。該方法已經(jīng)存在了很長(zhǎng)時(shí)間，研究界已經(jīng)證明了它的可靠性和穩(wěn)健性。同樣，qPCR循環(huán)儀制造商開(kāi)發(fā)了可靠的平臺(tái)，液體處理自動(dòng)化設(shè)備供應(yīng)商開(kāi)發(fā)了與qPCR兼容的自動(dòng)化解決方案（例如機(jī)器人）。

  最明顯的是qPCR在分子診斷中的應(yīng)用，它正在慢慢取代傳統(tǒng)方法。它用于檢測(cè)、鑒定和量化導(dǎo)致疾病的微生物（細(xì)菌、病毒和真菌）。使用qPCR可以減少手工勞動(dòng)，同時(shí)還可以減少對(duì)污染和錯(cuò)誤結(jié)果的擔(dān)憂。它還可以在更短的時(shí)間內(nèi)處理大量樣本（每次運(yùn)行最多384個(gè)甚至1536個(gè)反應(yīng)），因此已被證明是診斷實(shí)驗(yàn)室中不可替代的方法。但必須注意的是，該方法僅檢測(cè)微生物DNA或RNA的存在，而不會(huì)報(bào)告其活力。因此，有時(shí)仍需要同時(shí)使用傳統(tǒng)的微生物技術(shù)。

  qPCR還用于檢測(cè)和量化轉(zhuǎn)基因生物或進(jìn)行基因分型。后者意味著可以檢測(cè)同一基因的不同等位基因或單核苷酸多態(tài)性(SNP)，這些可用作某些疾病的遺傳診斷或預(yù)后標(biāo)記。

  基因表達(dá)研究是非常重要的應(yīng)用領(lǐng)域，它幫助我們了解生物學(xué)、微生物學(xué)、醫(yī)學(xué)和其他生命科學(xué)等各個(gè)領(lǐng)域的生物過(guò)程。一種非常有用、幾乎轟動(dòng)一時(shí)的組合是使用DNA微陣列進(jìn)行全基因組基因表達(dá)篩選，然后使用qPCR驗(yàn)證結(jié)果。DNA微陣列本身就是一種非常有效的方法，但它們的靈敏度較低，仍然需要驗(yàn)證。