RT-PCR:逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）是一種分子技術(shù)。聚合酶聯(lián)式反應(yīng)（PCR）是一種實(shí)驗(yàn)方法，用于擴(kuò)增DNA特定區(qū)域，以便在醫(yī)學(xué)研究中進(jìn)行分析和診斷。RT-PCR使用mRNA作為起始模板，是PCR的改良版。其中使用一種稱為逆轉(zhuǎn)錄酶的酶。這種酶有助于將RNA序列轉(zhuǎn)化為其互補(bǔ)DNA序列。RT-PCR就是基于逆轉(zhuǎn)錄的原理。它是一種實(shí)時(shí)技術(shù)，結(jié)合了RNA逆轉(zhuǎn)錄成DNA和靶DNA擴(kuò)增。它是一種定性檢測(cè)特定RNA序列的方法，具有很高的準(zhǔn)確性和靈敏度。

凱瑞·穆利斯(KarryMullis)發(fā)現(xiàn)了RT-PCR，以促進(jìn)RNA檢測(cè)和量化。他因發(fā)明該技術(shù)并徹底改變了分子生物學(xué)領(lǐng)域而獲得了1993年諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)。

RT-PCR原理及步驟

RT-PCR是一種分子診斷工具，其工作原理是利用逆轉(zhuǎn)錄酶將RNA模板轉(zhuǎn)化為互補(bǔ)DNA(cDNA)。然后，該cDNA通過PCR進(jìn)行指數(shù)擴(kuò)增，形成多個(gè)副本，然后用于下游分析。

典型的PCR以DNA為模板，所用的酶為Taq聚合酶。然而，為了擴(kuò)增RNA，需要進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，因?yàn)?/span>RNA不是Taq聚合酶的有效模板。因此，改良版PCR增加了一個(gè)額外的步驟，即先將RNA轉(zhuǎn)化為DNA，然后再進(jìn)行PCR。

首先，典型的RT-PCR檢測(cè)需要核酸、引物、逆轉(zhuǎn)錄酶、RNA樣本、DNA聚合酶和RT-PCR緩沖液。讓我們?cè)敿?xì)了解一下RT-PCR過程：

1.RNA分離完成后，提取RNA。

2.將提取的RNA樣本加入到反應(yīng)混合物中。反應(yīng)混合物由核苷酸、逆轉(zhuǎn)錄酶和針對(duì)目標(biāo)基因的特異性引物組成。

3.如果目標(biāo)存在，引物將與提取的RNA退火。

4.逆轉(zhuǎn)錄酶發(fā)揮合成互補(bǔ)DNA（cDNA）鏈的功能。

RNA/DNA雜交現(xiàn)在經(jīng)歷PCR步驟：

1.變性：在95oC時(shí)RNA/DNA鏈變性。

2.退火：引物退火至新形成的cDNA

3.延伸：從引物延伸，聚合酶通過復(fù)制合成新的DNA鏈。

4.熱循環(huán)儀中的多次循環(huán)會(huì)增加PCR產(chǎn)物中DNA的拷貝數(shù)。

此外，RT-PCR可以通過兩種不同的方式進(jìn)行：

一步法RT-PCR

該方法中，逆轉(zhuǎn)錄和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的反應(yīng)管是相同的，兩個(gè)過程同時(shí)進(jìn)行。這種簡(jiǎn)單方便的一步法適用于進(jìn)行少量的檢測(cè)。由于兩個(gè)反應(yīng)都在一個(gè)反應(yīng)管中進(jìn)行，因此使用的引物是序列特異性的。

RT-PCR