測定意義：

輔酶ⅡNADP(H)廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，NADP+和 NADPH 含量測定可以計算 NADP（NADPH + NADP+)含量和 NADPH/NADP+比值，其變化與磷酸戊糖途徑和生物合成以及抗氧化反應(yīng)密切相關(guān)。NADPH/NADP+比值不僅是細(xì)胞氧化還原態(tài)的主要標(biāo)志之一，而且在 PPP 途徑、生物合成和抗氧化代謝中具有重要調(diào)控作用。

測定原理：

分別用酸性和堿性提取液提取樣品中 NADP+和 NADPH。NADPH 通過 PMS 的遞氫作用，使氧化型噻唑藍(lán)（MTT）還原為甲瓚，570nm 下檢測吸光值，從而測定 NADPH 含量。利用 6-磷酸葡萄糖脫氫酶還原 NADP+

為 NADPH，從而檢測 NADP+含量。

所需的儀器和用品：

酶標(biāo)儀、臺式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、96 孔板、研缽、冰和蒸餾水。

NADP+和 NADPH 的提取：

1 血清（漿）中 NADP+和 NADPH 的提取

NADP+的提?。喊凑昭澹{）體積（mL）：酸性提取液體積（mL）為 1：5~10 的比例（建議取約 0.1mL血清（漿），加入 1mL 酸性提取液），95℃水浴 5min（蓋緊，以防止水分散失）；冰浴中冷卻后，10000g 4 ℃離心 10min；取 500μL 上清液，加入 500μL 堿性提取液使之中和，混勻，10000g 4 ℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

NADPH 的提?。喊凑昭澹{）體積（mL）：堿性提取液體積（mL）為 1：5~10 的比例（建議取約 0.1mL血清（漿），加入 1mL 堿性提取液），95℃水浴 5min（蓋緊，以防止水分散失）；冰浴中冷卻后，10000g 4 ℃離心 10min；取 500μL 上清液，加入 500μL 酸性提取液使之中和，混勻，10000g 4 ℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

2 組織中 NADP+和 NADPH 的提?。?

NADP+的提取：按照組織質(zhì)量（g）：酸性提取液體積（mL）為 1：5~10 的比例（建議取約 0.1g 組織，加入1mL 酸性提取液），冰浴研磨，95℃水浴 5min（蓋緊，以防止水分散失）；冰浴中冷卻后，10000g 4 ℃離心10min；取 500μL 上清液，加入 500μL 堿性提取液使之中和，混勻，10000g 4 ℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

NADPH 的提?。喊凑战M織質(zhì)量（g）：堿性提取液體積（mL）為 1：5~10 的比例（建議取約 0.1g 組織，加

入 1mL 堿性提取液），冰浴研磨，95℃水浴 5min（蓋緊，以防止水分散失）；冰浴中冷卻后，10000g 4 ℃

離心 10min；取 500μL 上清液，加入 500μL 酸性提取液使之中和，混勻，10000g 4 ℃離心 10min，取上清，

置冰上待測。

3 細(xì)胞或細(xì)菌中 NADP+和 NADPH 的提?。?

NADP+的提?。合仁占?xì)胞或細(xì)菌到離心管內(nèi)，棄上清，按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（104 個）：酸性提取液體積

（mL）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 酸性提取液），超聲波破碎（冰浴，功率

20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次），95℃水浴 5min（蓋緊，以防止水分散失）；冰浴中冷卻后，

10000g 4 ℃離心 10min；取 500μL 上清液，加入 500μL 堿性提取液使之中和，混勻，10000g 4 ℃離心

10min，取上清，置冰上待測。

NADPH 的提取：先收集細(xì)胞或細(xì)菌到離心管內(nèi)，棄上清，按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（104個）：堿性提取液體積

（mL）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 堿性提取液），超聲波破碎（冰浴，功率

20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次），95℃水浴 5min（蓋緊，以防止水分散失）；冰浴中冷卻后，

10000g 4 ℃離心 10min；取 500μL 上清液，加入 500μL 酸性提取液使之中和，混勻，10000g 4 ℃離心

10min，取上清，置冰上待測。

測定步驟：

1、 分光光度計或酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 570nm，蒸餾水調(diào)零。

2、 加樣表(在 1.5mL 棕色 EP 管中按下表依次加樣）：

混勻，取 200μL 轉(zhuǎn)移至微量石英比色皿或 96 孔板中，570nm 下讀取對照吸光值 A1 和測定管吸光值 A2，計算△A=A2-A1。

注意事項：

1、如果一次性測定樣本數(shù)較多，可將試劑一、二、三和四按比例配成混合液。

2、對照管和測定管的測定步驟的區(qū)別：對照管加完試劑一、二、三、四和五后必須馬上加試劑六；測定管

加完試劑一、二、三、四和五后必須反應(yīng) 20min 后再加試劑六。

3、反應(yīng)過程中注意避光。

4、若 NADP+測定中△A（A2-A1）≤0.0144，NADPH 測定中△A（A2-A1）≤0.0259，說明樣本中輔酶含量較低，已低于檢測限，可做如下調(diào)整：

（1）將測定管避光靜置時間20min延長到60min；

（2）在提取

階段增加取樣量，即取 0.2g樣本或 0.2mL 樣本加入 1mL 提取液。

5、由于每一個測定管需要設(shè)一個對照管，本試劑盒 100 管保證測 48個NADP+或 NADPH.

NADP+和 NADPH 含量的計算：

（一）NADP+含量的計算

標(biāo)準(zhǔn)條件下的回歸曲線為 y = 0.0985x + 0.0144，R2 = 0.9998；其中 y 為△A，x 為 NADP+濃度 nmol/mL

1、血清（漿）中 NADP+含量計算

NADP+含量(nmol/mL）=[ (△A -0.0144）÷0.0985×V1) ]÷(V3×V1÷V2)= 203×(△A -0.0144）

2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中 NADP+含量計算

(1)按樣本蛋白濃度計算

NADP+

(nmol/mg prot）=[(△A -0.0144）÷0.0985×V1) ]÷(V1×Cpr)= 10.2×(△A -0.0144）÷Cpr

(2)按樣本鮮重計算

NADP+

(nmol/g 鮮重）= [(△A -0.0144）÷0.0985×V1)] ÷(W×V1÷V2)=20.3×(△A -0.0144）÷W

(3)按細(xì)菌或細(xì)胞密度計算

NADP+

(nmol/10? cell）=[(△A -0.0144）÷0.0985×V1)] ÷(500×V1÷V2)=0.04×(△A -0.0144）

（二）NADPH 含量的計算

標(biāo)準(zhǔn)條件下的回歸曲線為 y = 0.6198x + 0.0259，R2 = 0.9977；其中 y 為△A，x 為 NADPH濃度nmol/mL

1、血清（漿）中 NADPH 含量計算

NADPH 含量(nmol/mL）= [(△A -0.0259）÷0.6198×V1)] ÷(V3×V1÷V2)= 32.3× (△A -0.0259）

2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中 NADPH 含量計算

(1)按樣本蛋白濃度計算

NADPH (nmol/mg prot）=[ (△A -0.0259）÷0.6198×V1)] ÷(V1×Cpr)= 1.6× (△A -0.0259）÷Cpr

(2)按樣本鮮重計算

NADPH (nmol/g 鮮重）=[(△A -0.0259）÷0.6198×V1) ]÷(W×V1÷V2)=3.2× (△A -0.0259）÷W

(3)按細(xì)菌或細(xì)胞密度計算

NADPH (nmol/10? cell）=[(△A -0.0259）÷0.6198×V1) ]÷(500×V1÷V2)=0.006× (△A -0.0259）V1：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.02mL；V2：加入提取液體積，2mL；V3：加入血清（漿）體積：

0.1mL；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL； W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500 萬。

注 意：最低檢測限為 0.01nmol/mL 或 0.01nmol/g 鮮重 或 0.001nmol/mg prot

上海紀(jì)寧生物一直致力于為廣大高校、科研院所和企事業(yè)單位提供輔酶ⅡNADP(H)含量試劑盒的科研試劑和完善的技術(shù)服務(wù)，滿足生物化學(xué)、分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)、免疫學(xué)等生物科技實驗需求。