細(xì)胞復(fù)蘇是生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的關(guān)鍵程序。確保溫和地解凍冷凍細(xì)胞對于保持其活力和功能至關(guān)重要。細(xì)胞復(fù)蘇是細(xì)胞培養(yǎng)第一步，因此這一步是非常關(guān)鍵的。了解細(xì)胞復(fù)蘇及步驟對于后續(xù)細(xì)胞培養(yǎng)比較關(guān)鍵，今天，為大家介紹一下細(xì)胞培養(yǎng)之細(xì)胞復(fù)蘇。

    細(xì)胞復(fù)蘇的原理

    細(xì)胞復(fù)蘇是指將凍存在液氮或者零下七十度冰箱中的細(xì)胞解凍后重新培養(yǎng)，使解凍后細(xì)胞重新恢復(fù)其生物活性和功能的過程，包括恢復(fù)正常的形態(tài)、貼壁、生長和增殖等。在細(xì)胞復(fù)蘇過程，要遵循原則是“慢凍快溶。”其目的是防止細(xì)胞解凍過程水份進(jìn)入細(xì)胞、形成冰晶而影響細(xì)胞存活。

    細(xì)胞復(fù)蘇步驟

    從液氮罐取出凍存管，應(yīng)立即放入三十七度水浴鍋中，不時(shí)輕柔搖動，使其1-2分鐘內(nèi)極速融化。注意在凍存管放入水浴鍋中水位應(yīng)該低于凍存管的蓋子， 避免水進(jìn)入凍存管造成污染。

    待完全融化后，凍存管取出用百分之七十五的酒精擦拭冷凍管外殺菌后，待酒精恢發(fā)，打開蓋子取出凍存管細(xì)胞懸浮液，緩慢滴加到有培養(yǎng)液的T25或者是T75的培養(yǎng)瓶中，如果細(xì)胞數(shù)量較少，建議先用T25培養(yǎng)瓶，待細(xì)胞生長至一定密度后再傳代至T75培養(yǎng)瓶，這樣可以提供更適宜的生長環(huán)境。在37℃、5%CO培養(yǎng)。如果細(xì)胞在凍存中用到細(xì)胞凍存液，凍存液含有DMSO，DMSO對細(xì)胞有一定毒性，建議在細(xì)胞復(fù)蘇后進(jìn)行一次低速離心（例如1000rpm，5分鐘），去除含有DMSO的凍存液，再用新鮮培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，可以減少DMSO對細(xì)胞的損傷，提高細(xì)胞活力。

    用培養(yǎng)液稀釋適當(dāng)稀釋后，將重懸的細(xì)胞接種到培養(yǎng)皿或者T25或者是T75的培養(yǎng)瓶中，37℃、5%CO培養(yǎng)，二十四小時(shí)后，更換新鮮培養(yǎng)基，去除死細(xì)胞，三天進(jìn)行更換一次，當(dāng)細(xì)胞長到有80-90%匯合進(jìn)行傳代。

    細(xì)胞復(fù)蘇過程注意事項(xiàng)

    1）在取凍存細(xì)胞時(shí)應(yīng)做好個(gè)人防護(hù)工作，戴好手套和護(hù)目鏡。由于解凍時(shí)凍存管的溫度急劇上升，將可能會發(fā)生破裂和泄露。因此為了避免凍存管安全問題，給大家總結(jié)如下建議：

    1.選擇高質(zhì)量的凍存管:選擇正規(guī)廠家生產(chǎn)的、質(zhì)量可靠的凍存管，確保其能夠承受溫度的劇烈變化。

    2.檢查凍存管密封性:在使用前，仔細(xì)檢查凍存管是否有裂縫或破損，確保其密封性良好。

    3.使用專用凍存盒:使用帶有透氣孔的專用凍存盒來保存和取出凍存管，可以減少液氮進(jìn)入管內(nèi)的風(fēng)險(xiǎn)。

    4.快速解凍，但避免溫度驟變:將凍存管從液氮中取出后，要盡快放入37度水浴鍋中解凍，但要避免將凍存管直接扔進(jìn)水浴鍋，可以先用手握住凍存管幾秒鐘，使其稍微回溫，然后再放入水中。

    5.水浴時(shí)，水位低于蓋子:水浴過程中，要確保水位低于凍存管的蓋子，避免水進(jìn)入管內(nèi)。

    6.戴防護(hù)裝備:進(jìn)行細(xì)胞復(fù)蘇操作時(shí)，要佩戴防護(hù)眼鏡和手套，以防萬一發(fā)生意外。

   2） 細(xì)胞放入水浴鍋中復(fù)蘇時(shí)，用鑷子夾住細(xì)胞凍存管，并在水浴中輕柔的搖動，使其受熱均勻，且速度越快越好，這樣可以最大限度的保存細(xì)胞活力，并防止水浴鍋中的水進(jìn)入細(xì)胞凍存管造成細(xì)胞污染。

    3）打開細(xì)胞凍存管之前需用酒精棉球?qū)龃婀芟竞蟛⒘栏?，?xì)胞復(fù)蘇后，我盡快恢復(fù)到正常的生理狀態(tài)，所以應(yīng)該盡快將其轉(zhuǎn)移到37℃的培養(yǎng)箱中。

    4）解凍時(shí)間在1-2分鐘完成，整個(gè)過程盡量避免吹打細(xì)胞，導(dǎo)致細(xì)胞復(fù)蘇后生長狀態(tài)不佳。細(xì)胞懸浮 可以用輕輕搖晃或者傾斜混勻的方式代替。

    5）細(xì)胞復(fù)蘇過程盡量避免凍存管沾水，防止支原體污染，實(shí)驗(yàn)室定期用過氧化氫熏蒸，細(xì)胞小黑點(diǎn)增多時(shí)用支原體檢測試劑盒檢測，并且及時(shí)清除。