紀寧生物甲醛脫氫酶(FDH)測試盒測定原理
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注 意：正式測定之前選擇 2-3 個預期差異大的樣本做預測定。
測定意義：
甲醛是一種能與蛋白質(zhì)、核酸和脂類產(chǎn)生非特異性反應的活潑化合物，對所有生物都具有很高毒性。甲醛
脫氫酶作為含鋅中等鏈醇脫氫酶（ADH）的家庭成員之一，廣泛存在于原核和真核生物中，該酶能利用 NAD+
作為輔酶，將有毒的甲醛氧化，是甲醛氧化途徑中的關鍵酶。
測定原理：
甲醛脫氫酶催化甲醛和 NAD+產(chǎn)生 NADH，在 340nm 處的吸光值會增加，測定 340nm 處的吸光值變化，可
計算得到甲醛脫氫酶的活性。
自備實驗用品及儀器：
天平、離心機、分光光度計、1mL 玻璃比色皿、蒸餾水。
試劑組成和配制：
提取液：液體 60mL×1 瓶，4℃保存。
試劑一：液體 30mL×1 瓶，4℃保存。
試劑二：粉劑×1 瓶，-20℃保存；臨用前加入 15mL 水溶解待用，用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復
凍融。
試劑三：粉劑×1 瓶，4℃保存；臨用前加入 3mL 水溶解待用。
試劑四：液體 3mL×1 瓶，4℃避光保存。
FDH 提?。?
1. 組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1mL 提
取液）進行冰浴勻漿，然后 10000g，4℃，離心 20min。
2. 細胞：按照細胞數(shù)量（104個）：提取液體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細胞加入 1mL
提取液），冰浴超聲波破碎細胞（功率 300w，超聲 3 秒，間隔 7 秒，總時間 3min）；然后 10000g，
4℃，離心 10min，取上清置于冰上待測。
3. 液體：直接檢測。
測定操作表：
1、 分光光度計預熱 30min，調(diào)節(jié)波長至 340nm，蒸餾水調(diào)零。
2、 操作表
在比色皿中加入如下試劑
測定管
樣本（μL） 100
試劑一（μL） 550
試劑二（μL） 250
試劑三（μL） 50
試劑四（μL） 50
混勻，于 340nm 下測定初始吸光值 A1 與 5min 后的吸光值 A2，△A=A2-A1。
若樣本數(shù)量較多，可將試劑按比例配成工作液使用。
FDH 酶活計算：
（1）按蛋白濃度計算
酶活定義：每毫克蛋白每分鐘催化還原 1nmol NAD+的酶量為 1 個酶活單位。
FDH 酶活（nmol/min/mg prot）= ×V 反總÷（V 樣×Cpr）÷T = 322×△A÷Cpr
（2）按樣本質(zhì)量計算
酶活定義：每克樣品每分鐘催化還原 1nmol NAD+的酶量為 1 個酶活單位。
FDH 酶活（nmol/min/g 鮮重）= ×V 反總÷（V 樣×W÷V 樣總）÷T =322×△A÷W
（3）按照細胞數(shù)量計算
酶活定義：每 10?個細胞每分鐘催化還原 1nmol NAD+的酶量為 1 個酶活單位。
FDH 酶活（nmol/min/10?cell）= ×V 反總÷（V 樣÷V 樣總×細胞數(shù)量（萬個））÷T= 322×△A÷細胞數(shù)量
（4）按液體體積計算
酶活定義：每 mL 樣本每分鐘催化還原 1nmol NAD+的酶量為 1 個酶活單位。
FDH 酶活（nmol/min/mL）= ×V 反總÷V 樣÷T=322×△A
：NADH 微摩爾消光系數(shù)，6.22×10-3 L/μmol/cm；d：比色皿光徑，1cm；V 反總：反應體系總體積，
1mL；V 樣：反應體系中樣本體積，0.1mL；V 樣總：加入提取液體積，1mL；T，反應時間，5min；Cpr：樣
本蛋白濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g
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