土壤幾丁質(zhì)酶（Soil Chitinase，S-Chitinase）試劑盒說明書

注 意 ：正式測定之前選擇 2-3 個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。

測定意義：

幾丁質(zhì)主要存在于蝦、蟹、昆蟲等甲殼類動物的外殼與軟體動物的器官(例如烏賊的軟骨)，以及真菌類的細(xì)胞壁中，而幾丁質(zhì)酶(EC 3.2.1.14)可催化幾丁質(zhì)水解，具有抵御真菌侵染的作用，成為抗真菌病害的研究熱點(diǎn)。

測定原理：

幾丁質(zhì)酶水解幾丁質(zhì)產(chǎn)生 N-乙酰氨基葡萄糖，進(jìn)一步與對二甲氨基苯甲醛產(chǎn)生紅色化合物，在 585nm 處有特征吸收峰，吸光值增加速率反映了幾丁質(zhì)酶的活性。

自備實(shí)驗(yàn)用品及儀器：

天平、水浴鍋、離心機(jī)、震蕩儀、可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96 孔板，甲苯、蒸餾水。

試劑組成和配制：

試劑一：液體 10mL×1 瓶，4℃保存。

試劑二：液體 4mL×1 瓶，4℃保存。

試劑三：液體 65mL×1 瓶，4℃避光保存。

樣品處理：

新鮮土樣風(fēng)干，過 30-50 目篩。

測定操作表：

對照管 測定管

土樣（g） 0.1 0.1

甲苯（μL） 15 15

混勻，25℃靜置 15min

蒸餾水（μL） 100

試劑一（μL） 100

混勻，37℃培養(yǎng) 24h

蒸餾水（μL） 200 200

4000rpm，4℃，離心 10min，取上清 200μL 于新的 EP 管中

試劑二（μL） 20 20

混勻，沸水浴 5min

試劑三（μL） 600 600

混勻，37℃顯色 20min，取 200μL 于微量石英比色皿/96 孔板中，蒸餾水調(diào)零，測定 585nm 處吸光值，記為 A 對照管和 A 測定管，ΔA=A 測定管-A 對照管。

計(jì)算公式：

a. 用微量石英比色皿測定的計(jì)算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=5.2714x-0.0007，R2=0.9989；x 為標(biāo)準(zhǔn)品濃度（mg/mL），y 為吸光值 ΔA。

酶活性定義：37℃條件下，每克土壤每天分解幾丁質(zhì)產(chǎn)生 1μg N-乙酰氨基葡萄糖的酶量為一個酶活性單位。

土壤幾丁質(zhì)酶活性（μg/d/g 土樣）=（ΔA +0.0007）÷5.2714×V 反總÷W÷T×1000= 598×（ΔA +0.0007）

V 反總：反應(yīng)體系總體積，0.315mL；W：樣本質(zhì)量，0.1g；T：反應(yīng)時間，1d；1000：1mg/mL=1000μg/mL

b. 用 96 孔板測定的計(jì)算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)曲線：y=2.6357x-0.0007，R

2=0.9989；x 為標(biāo)準(zhǔn)品濃度（μg/mL），y 為吸光值 ΔA。

酶活性定義：37℃條件下，每克土壤每天分解幾丁質(zhì)產(chǎn)生 1μg N-乙酰氨基葡萄糖的酶量為一個酶活性單位。

土壤幾丁質(zhì)酶活性（μg/d/g 土樣）=（ΔA +0.0007）÷2.6357×V 反總÷W÷T×1000= 1195×（ΔA +0.0007）

V 反總：反應(yīng)體系總體積，0.315mL；W：樣本質(zhì)量，0.1g；T：反應(yīng)時間，1d；1000：1mg/mL=1000μg/mL

注意事項(xiàng)：

試劑一充分混勻后再使用。
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