注 意：正式測定之前選擇 2-3 個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。

測定意義：

硝酸還原酶（NiR）是一類能催化亞硝酸鹽還原的酶，廣泛存在于微生物及植物體內(nèi)，是自然界氮循環(huán)過程中的關(guān)鍵酶，可以將亞硝酸鹽降解為 NO 或 NH3，從而減少環(huán)境中亞硝態(tài)氮的積累，降低因亞硝酸鹽累積而造成的對生物體的毒害作用。

測定原理：

亞硝酸還原酶可將 NO2—還原為 NO，使樣品中參與重氮化反應(yīng)生成紫紅色化合物的 NO2—減少，即 540nm處吸光值的變化可反映亞硝酸還原酶的活性。

需自備的儀器和用品：天平、研缽、可見分光光度計/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96 孔板、水浴鍋、低溫離心機。

試劑的組成和配制：

提取液：液體 112mL×1 瓶，4℃保存。

試劑一：液體 4mL×1 瓶，4℃保存。

試劑二：粉劑×1 瓶，4℃保存。臨用前加 5mL 蒸餾水溶解。

試劑三：液體 5mL×1 瓶，4℃保存。（如出現(xiàn)沉淀可以 70-80℃加熱溶解）

試劑四：液體 10mL×1 瓶，4℃避光保存。（如出現(xiàn)沉淀可以 70-80℃加熱溶解）

試劑五：液體 10mL×1 瓶，4℃避光保存。

工作液：臨用前根據(jù)用量將試劑四和試劑五以 1:1 的比例混合。

酶液提?。?

1. 組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1mL提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。10000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

2．細(xì)菌、真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（10?個）：提取液體積（mL）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細(xì)胞加入1mL提取液），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率300w，超聲3秒，間隔 7 秒，總時間 3min）；然后 10000g，4℃離心 10min，取上清置于冰上待測。

測定操作表：

空白管 對照管 測定管

樣本（μL） 20 20

蒸餾水（μL） 20 40

試劑一（μL） 40 40

試劑二（μL） 40 40 40

混勻后，25℃反應(yīng) 1h

試劑三（μL） 40 40 40

充分震蕩 30S

上清液（μL）70 70 70

工作液（μL）140 140 140

充分混勻，，靜置 3min 后測定各管 540nm 處吸光值，分別記為 A 空白管、A 對照管、A 測定管。空白管只要做一管，每個測定管需設(shè)一個對照管。

計算公式：

a. 使用微量石英比色皿測定的計算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)曲線：y = 1.3594x + 0.0072，R2 = 0.9997；x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度（μmol/mL），y 為吸光值（A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白管）。

1．按照蛋白含量計算

酶活單位定義：每毫克組織蛋白每小時還原 1μmol NO2ˉ的量為一個酶活力單位。

NiR（μmol/h /mg prot）= [A 空白管-(A測定管-A 對照管)-0.0072]÷1.3594×V 標(biāo)÷（V 樣×Cpr）÷T = 1.47×（A 空白管-A 測定管+A 對照管-0.0072）÷Cpr

2. 按照樣本質(zhì)量計算

酶活單位定義：每克組織每小時還原 1μmol NO2ˉ的量為一個酶活力單位。

NiR（μmol/h/g 鮮重）=[A 空白管-(A 測定管-A 對照管)-0.0072]÷1.3594×V 標(biāo)÷（W ×V 樣÷V 樣總）÷T =1.47×（A 空白管-A 測定管+A 對照管-0.0072）÷W

3. 按照細(xì)胞數(shù)量計算

酶活單位定義：每 10?個細(xì)胞每小時還原 1μmol NO2ˉ的量為一個酶活力單位。NiR（μmol/h /10?cell）= [A 空白管-(A 測定管-A 對照管)-0.0072]÷1.3594×V 標(biāo)÷（細(xì)胞數(shù)量×V 樣÷V 樣總）÷T = 1.47×（A 空白管-A 測定管+A 對照管-0.0072）÷細(xì)胞數(shù)量V 標(biāo)：標(biāo)準(zhǔn)液體積，0.04mL；V 樣：體系中加入樣本體積，0.02mL；V 樣總：加入提取液體積，1mL；T：

反應(yīng)時間，1h； Cpr：樣本蛋白含量；W：樣本質(zhì)量，g

b. 使用 96 孔板測定的計算公式如下

標(biāo)準(zhǔn)曲線：y = 0.6797x + 0.0072，R2 = 0.9997；x 為標(biāo)準(zhǔn)品濃度（μmol/mL），y 為吸光值（A 標(biāo)準(zhǔn)管-A 空白

管）。

1．按照蛋白含量計算

酶活單位定義：每毫克組織蛋白每小時還原 1μmol NO2ˉ的量為一個酶活力單位。NiR（μmol/h /mg prot）= [A 空白管-(A 測定管-A 對照管)-0.0072]÷0.6797×V 標(biāo)÷（V 樣×Cpr）÷T = 2.94×（A 空白管-A 測定管+A對照管-0.0072）÷Cpr

2. 按照樣本質(zhì)量計算

酶活單位定義：每克組織每小時還原1μmol NO2ˉ的量為一個酶活力單位。NiR（μmol/h/g 鮮重）=[A 空白管-(A測定管-A 對照管)-0.0072]÷0.6797×V 標(biāo)÷（W ×V 樣÷V 樣總）÷T =

2.94×（A 空白管-A 測定管+A 對照管-0.0072）÷W

3. 按照細(xì)胞數(shù)量計算

酶活單位定義：每 10?個細(xì)胞每小時還原 1μmol NO2ˉ的量為一個酶活力單位。NiR（μmol/h /10?cell）= [A 空白管-(A 測定管-A 對照管)-0.0072]÷0.6797×V 標(biāo)÷（細(xì)胞數(shù)量×V 樣÷V 樣總）÷T = 2.94×（A 空白管-A 測定管+A 對照管-0.0072）÷ 細(xì)胞數(shù)量V 標(biāo)：標(biāo)準(zhǔn)液體積，0.04mL；V 樣：體系中加入樣本體積，0.02mL；V 樣總：加入提取液體積，1mL；T：

反應(yīng)時間，1h； Cpr：樣本蛋白含量；W：樣本質(zhì)量，g

注意事項：

1. 配制好的工作液 3 天內(nèi)使用完。

2. 若吸光值超過 1.5，將上清液進(jìn)行適當(dāng)?shù)南♂尯笤偌尤牍ぷ饕猴@色，并在計算公式中乘以稀釋倍數(shù)。

3. 嚴(yán)格控制顯色時間，否則會對結(jié)果有影響。

4. 標(biāo)準(zhǔn)曲線線性范圍為 0.03μmol/mL-1.5μmol/mL。

5. A 空白管-（A 測定管-A 對照管）線性范圍為 0.02-1.5。

上海紀(jì)寧生物科技有限公司自成立以來，一向以“優(yōu)異亞硝酸還原酶(NiR)測試盒的產(chǎn)品，優(yōu)惠的報價和交心的服務(wù)”得到廣闊新老客戶的必定和支撐，不斷提高自身的專業(yè)技術(shù)水平和服務(wù)質(zhì)量，為您提供非常好的產(chǎn)品。